[发明专利]一种软骨再生干细胞制剂及其应用有效
| 申请号： | 201510667021.3 | 申请日： | 2015-10-15 |
| 公开（公告）号： | CN105176924B | 公开（公告）日： | 2019-05-03 |
| 发明（设计）人： | 李承根;朴贞洙 | 申请（专利权）人： | 绵阳未来细胞生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/0775 | 分类号： | C12N5/0775;C12N5/077 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 龚燮英 |
| 地址： | 621000 四川*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 软骨 再生 干细胞 制剂 及其 应用 | ||
1.一种软骨再生干细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)血清分离：从患者身上采集50ml血液，在常温中放置1-3小时进行凝固；之后以1000-3000rpm，4℃离心5-20分钟，收集血清；血清用灭菌的0.2μm网过滤，分装后在-20℃条件下长期保存；血清使用前在50-60℃水浴中进行灭活处理20-40分钟；
(2)分离脂肪干细胞：利用一般吸脂术从患者的大腿和/或腹部提取20-30ml脂肪；提取的脂肪组织利用磷酸盐缓冲液PBS和裂解缓冲液洗涤3-4次以清除红血球；洗涤完毕后在1.5mg/ml胶原酶37℃条件下处理0.5-2小时，搅拌反应后1000-2000rpm离心5-20分钟，分离提取出脂肪干细胞；利用100μm细胞筛过滤，过滤液1000-2000rpm离心5-20分钟，分离提取高纯度的脂肪干细胞；
(3)培养脂肪干细胞：分离出的高纯度脂肪干细胞在0.5-2g/L葡萄糖，0.5-2％青霉素或链霉素，含有5-20％血清的DMEM培养基在37℃，5％CO2浓度条件下培养，24小时后更换培养基清除未附着的细胞并每3天更换一次培养基；
(4)软骨再生干细胞制剂的准备：培养出的脂肪干细胞通过胰酶-EDTA处理，用1000-2000rpm离心10分钟，离心完毕后用PBS溶液洗涤3-4次；提取1.0×108个脂肪干细胞；用台盼蓝染色确认细胞的成活率；在这些细胞中添加4-10ng/ml的细胞生长因子TGF-beta，50-200ug/ml的血小板反应蛋白2，90-400ng/ml的重组人骨形态发生蛋白-2，90-400ng/ml的人骨形态发生蛋白-7后再追加1％透明质酸1-2ml制成自体干细胞混合制剂；
所述步骤(3)中血清为自体血清。
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