[发明专利]一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用

权利要求书

1.一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母，其特征在于，分类命名为巴斯德毕赤酵母zfwx-208菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2013518，保藏日期为：2013年10月30日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：（1）一级种子的培养：取试管斜面保藏的菌株zfwx-208，接入至一级种子培养基上，在30℃摇床中振荡培养22-26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；

（2）二级种子的培养：每升无机盐培养基中加入4mL的微量元素溶液后，再调整pH值到5.0，将一级摇瓶种子接种到加入微量元素溶液后的无机盐培养基上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2v/v·m，搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h；

（3）高密度发酵：

A、在发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为7500：1，对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30分钟，灭菌结束后，对发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当发酵培养基温度降至35℃时，向发酵罐中补加微量元素溶液，并调pH至5.0，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：25；所述的发酵培养基为无机盐培养基；

B、将培养好的二级种子接入到A步骤发酵罐中的发酵培养基上，在温度30-32℃，通气量为0.6～0.8v/v·m，搅拌转速为60-80rpm的条件下进行培养，每隔4小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到60g/L以上后，通气量加大至1.0～1.5v/v·m，搅拌转速提高到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20小时后，开始以20-30Kg/h的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到140g/L时，停止甘油流加，当甘油利用完后，发酵罐上溶氧电极显示溶氧上升，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.8%～1.2%，同时开大发酵罐进气阀门，保证发酵液中溶氧达到30%以上；

（4）诱导产酶：甲醇流加24-30h后，降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH至4.0-4.5，每隔3-4小时流加发酵液体积的0.5-0.6‰的微量元素溶液，当发酵液中菌体湿重达到400-450g/L时，酶活性达到20000U/mL且不再增长，收集发酵液；

（5）酶的提取：

a、利用蝶片离心机对上述（4）步骤收集的发酵液进行分离，蝶片离心机转速12000rpm，进液量500L/h，分别收集上清液和重相；

b、重相加重相体积1倍的清水，搅拌均匀，再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述a步骤收集的上清液合并；经截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，收集到酶液储存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量=脂肪酶浓缩液总酶活/计划固体酶活性；其中，脂肪酶浓缩液总酶活指单位体积脂肪酶浓缩液的酶活性与脂肪酶浓缩液总体积的乘积，计划固体酶活性指准备生产得到的固体酶活性，搅拌均匀，输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用；

（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，喷雾干燥结束后，收集干粉即为脂肪酶；

（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述（5）中b步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白悬液，加入清水，悬液中菌体湿重为700-750g/L，送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白；

所述的一级种子培养基为YPD培养基，是由重量百分比计的酵母浸膏1%、胰蛋白胨2%、葡萄糖2%和余量的水混合在一起组成；

所述的无机盐培养基是由磷酸氢二铵5.16g、石膏粉0.22g、硫酸钾8.12g、硫酸亚铁0.42g，七水硫酸镁6.5g、氯化钾1.68g、甘油40g和质量浓度98%的硫酸5mL加水至1L制成，用氨水调pH值至5.0；

所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜2.2g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4.5g，二水钼酸钠0.3g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.1g，氯化锌8g，七水合硫酸亚铁32g，质量浓度98%的浓硫酸3mL和生物素0.2g加水至1L制成。

3.根据权利要求1所述的一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）一级种子的培养：一级种子培养基采用YPD培养基，用2000mL三角瓶分装，每瓶装液量为500mL，瓶口用8层纱布包裹，121℃灭菌30min后冷却备用，取3-5支试管斜面保藏的菌株zfwx-208，用接种环刮下并接入至有500mL一级种子培养基的三角瓶中，每支试管斜面接种两瓶，接种后在30℃摇床中振荡培养22-26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；

（2）二级种子的培养：二级种子培养基采用无机盐培养基，121℃灭菌30min后冷却，再在每升无机盐培养基中加入4mL经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的微量元素溶液，得培养液，先在发酵罐中放入60L培养液，进行实罐灭菌，冷却后用磷酸或氨水调整培养液pH值到5.0，取样镜检一级摇瓶种子生长情况，将个体较大，发芽2-3个，无杂菌感染的一级摇瓶种子3-4L接入到发酵罐中的培养液上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2v/v·m，搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h，得二级种子；

（3）高密度发酵：在5m³发酵罐装1.5m³的发酵培养基和200mL聚醚改性硅消泡剂，打开发酵罐上的盘管的进出口蒸汽阀门，使蒸汽进入盘管并对发酵培养基加热，待温度升至80℃时，打开蒸汽阀门，使蒸汽分别从发酵罐的底部放料口、空气进口、取样口进入到发酵罐内，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30min，同时，用蒸汽依次对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后，对发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当发酵培养基温度降至35℃时，向发酵罐中补加经过滤除菌的微量元素溶液60L，并用氨水调节pH至5.0；

将上述培养好的二级种子60L接入到上述5m³发酵罐中的发酵培养基上进行培养，在30-32℃，通气量为0.6～0.8v/v·m，搅拌转速为60-80rpm的条件下开始培养，每隔4小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到65g/L以上后，通气量加大至1.0～1.5v/v·m，提高搅拌转速到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20小时后，发酵培养基中甘油消耗完，溶氧开始上升，此时，开始以20-30Kg/h的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到140g/L时，开始停止甘油流加，当甘油利用完后，发酵罐上溶氧电极显示溶氧上升，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.8%～1.2%，同时加大发酵罐通气量，即保证发酵液中溶氧达到30%以上；

（4）诱导产酶：甲醇流加24-30h后，发酵液中菌体，即单细胞甲醇蛋白已完成营养转型，湿重持续升高，酵母细胞开始形成酶蛋白，此时开始诱导脂肪酶生产，即降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH至4.0-4.5，每隔3-4小时流加2-3L微量元素溶液，诱导产酶60-70小时后，发酵液中菌体湿重达到400-450g/L，酶活性达到20000U/mL以上，随后每隔3小时取样测定酶活性，当酶活比上次酶活增长量低于5%时，收集发酵液；

（5）酶的提取：利用蝶片离心机对上述（4）步骤所得的发酵液中单细胞甲醇蛋白菌体进行分离，方法是：

A、蝶片离心机转速12000rpm，进液量500L/h，分别收集轻相和重相，轻相即上清液，重相即单细胞甲醇蛋白菌体；

B、取重相，加重相体积1倍的清水，搅拌均匀，让沾附在细胞表面的酶及无机盐洗脱下来，然后再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述A步骤收集的上清液合并，两次离心收集的上清液再经截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，取样测定酶活性，将脂肪酶浓缩液收集到2m³的酶液储存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量（g）=脂肪酶浓缩液总酶活/计划固体酶活性，并搅拌均匀，通过出料泵输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用；

（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后收集干粉即为脂肪酶；

（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述（5）中B步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白菌体，加入清水，得悬液，悬液中菌体湿重达到700-750g/L，然后通过输送泵送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白。