[发明专利]一种提高利福霉素SV发酵合成效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高利福霉素SV发酵合成效率的方法。本发明属于生物制药发酵工程领域，特别是涉及一种通过调控微生物碳氮代谢流向、增强利福霉素SV前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成，促进前体均匀性供给，提高利福霉素SV合成效率的方法。

背景技术

做为结核病治疗的大宗抗生素原料药，提高利福霉素发酵合成效率一直备受生产企业和研究单位关注。目前，国内外对提高利福霉素发酵效价的研究较多，包括：生产菌种的分子生物学信息特征、发酵培养基优化等方面，如对比文献1：在10L罐水平添加豆油和丙氨酸可提高利福霉素SV效价12.3％(食品与发酵工业，商纯良，2011，37(5)：56-60)；对比文献2：在50吨大罐水平添加豆油和乙二酸可使利福霉素SV发酵十亿提高5.4％(发明专利ZL201210176175.9)；对比文献3：添加丙氨酸、豆油和磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇可使利福霉素SV效价平均提高17.0％(发明专利申请号201210176177.8)。但是，对比文献1只涉及豆油和丙氨酸存在交互作用，在确定的优化浓度下，利福霉素SV效价提高12.3％，并对生产菌种的糖酵解途径碳代谢、有机酸合成效率以及效价合成的影响进行了初步的分析，并没有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率对利福霉素SV的氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成的影响；对比文献2涉及豆油和乙二酸的双重作用调节三羧酸循环中的关键步骤---琥珀酸脱氢酶催化的反应的活性，通过促进利福霉素SV前体---甲基丙二酰CoA的合成代谢效率来提高利福霉素SV的合成效率，也没有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率对利福霉素SV的氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成的影响；对比文献3中并没有提到磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇起到的作用，应用该方法带来的增产效果也无法断定是磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇的作用结果，对比现有技术(对比文献1)仅知道：豆油和丙氨酸具有调节利福霉素SV发酵的作用，即关于磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇调节利福霉素SV发酵的发明内容没有充分的证明、公开不充分，而且该文献也没有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率对利福霉素SV的氮环(前体3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成的影响。

芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)生物合成的限速酶之一是5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶(底物是磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸-莽草酸)，而色氨酸会显著抑制利福霉素SV的核心氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成效率。因此，通过抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶的活性，可以降低芳香族氨基酸在发酵中后期的合成与积累，特别是降低色氨酸对利福霉素SV前体3-氨基-5-羟基苯甲酸合成的抑制作用。与5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶的底物(如磷酸烯醇式丙酮酸)分子结构相似的小分子可能具有对该酶的抑制功能。

磷霉素钠是临床使用的抗生素，主要通过抑制敏感致病菌细胞壁的合成来治疗呼吸道感染、皮肤软组织感染、肠道感染等的治疗，成人静脉滴注剂量为：一日4～12g。磷霉素分子结构与磷酸烯醇式丙酮酸分子结构类似，但是，没有关于磷霉素钠作为代谢调控因子作用于地中海拟无枝酸菌的新功能的报道，即：通过抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶活性来降低芳香族氨基酸合成效率、提高利福霉素SV氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸前体合成效率、促进利福霉素SV发酵产量的新功能的报道。

利福霉素SV分子氮环的氮原子来源于谷氨酰胺(Gln)，在谷氨酰胺合成酶(GS)催化下，将谷氨酸(Glu)转化为谷氨酰胺。另外，谷氨酰胺在谷氨酸合成酶(GOGAT)催化下还可以转化为谷氨酸。发酵过程中胞外谷氨酸浓度越高反映出消耗的谷氨酰胺越多，即没有用于氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成而是流入Glu旁路代谢的Gln也就越多，而这对于AHBA前体合成和利福霉素SV合成是不利的。因此，提高发酵过程中的Gln有效供给、减少由Gln向Glu的代谢流可能会有效提高利福霉素SV的合成效率。GOGAT的催化产物是Glu，该酶活性存在受到其产物抑制的反馈作用。因此，Glu作为代谢调控因子，在适当的发酵周期添加到发酵液可能会对AHBA的合成产生积极作用。

通常谷氨酸钠是作为鲜味剂在食品行业被广泛使用，没有关于谷氨酸钠作为代谢调控因子作用于地中海拟无枝酸菌的新功能的报道，即：通过作用于GOGAT的催化反应减少Gln的旁路消耗，促进Gln流向氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成途径、促进利福霉素SV发酵产量的新功能的报道。

发明内容