[发明专利]一种内源性的非编码小RNA miR-873的应用

说明书

本发明提供了一种内源性的非编码小RNA miR‑873的应用。尤其是miR‑873在用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物上的应用。此外，还可以用于制备调控A20基因的制剂，以及用于制备吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子TNFα的调控制剂。本发明证实miR‑873通过调控TNFα诱导蛋白‑3(A20)参与吗啡耐受形成，为miR‑873在治疗或缓解慢性疼痛及吗啡耐受药物上的应用打下重要基础。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。本发明涉及一种内源性的非编码小RNA的用途，具体涉及一种miR-873在制备用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物上的应用。

背景技术

吗啡作为一种经典的阿片类镇痛药物，广泛应用于临床急慢性疼痛治疗中。但是吗啡长期使用导致的吗啡耐受(Morphine tolerance,MT)是限制其临床应用的一大医学难题。由于吗啡耐受的机制尚不完全清楚，且缺乏有效的防治措施，因此吗啡耐受一直是慢性疼痛研究领域的热点。

MicroRNA(miRNA,miR)是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)加工而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3＇末端非翻译区(3'-UTR)结合，诱导靶mRNA降解或介导其翻译抑制，从而在转录后发挥调控靶基因的功能。既往对基因表达和功能改变的研究主要集中于转录水平以及基因产物的翻译后修饰调节，对靶基因mRNA翻译过程的调控研究甚少。miR通过抑制靶基因mRNA翻译或促进mRNA从翻译复合体中分离降解，快速持久降低靶蛋白水平，从而参与多种病理生理过程。近年研究表明，miRNA不仅与人类遗传性疾病及神经系统发育和一些重大疾病的发生发展密切相关，而且在慢性疼痛研究领域中也发挥重要作用。我们采用miRNA芯片技术发现吗啡耐受大鼠脊髓背角miR-873分子表达水平显著上调，且这些miRNAs的靶基因中有吗啡耐受相关基因，miRNA调控基因表达是通过机体内源性调控通路，具有更高的稳定性和组织相容性，更低的毒副作用，可能成为新的治疗策略。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种内源性的非编码小RNA miR-873的应用，制备用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物,所述的非编码小RNA miR-873的序列为：GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU。

上述用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物包括：慢病毒介导的miR-873干扰载体。

根据miR-873序列，利用shRNA设计程序，按照RNA干扰序列设计原则，设计干扰靶点序列；将载体进行酶切，使其线性化，通过T4DNA连接酶与双链干扰靶点序列进行连接反应形成shRNA表达载体，将连接好的产物转入制备好的感受态大肠杆菌，对长出的克隆进行酶切鉴定，挑选阳性克隆测序，进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的shmiR-873干扰慢病毒载体；然后对构建成功的shmiR-873干扰载体进行慢病毒包装。

具体是根据miR-873序列，利用shRNA设计程序，按照RNA干扰序列设计原则，设计干扰靶点序列5’-AUAAGGAUUUUUAGGGCAUUA-3’；将pLenR-GPH载体两端分别以EcoR Ⅰ、BamHⅠ为酶切位点进行酶切，使其线性化，通过T4DNA连接酶与双链干扰靶点序列进行连接反应形成shRNA表达载体，将连接好的产物转入制备好的感受态大肠杆菌，对长出的克隆进行酶切鉴定，挑选阳性克隆测序，进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的shmiR-873干扰载体；