[发明专利]一种检测肾移植患者在术后感染巨细胞病毒危害程度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于评估肾移植患者在术后感染巨细胞病毒所带来不同危害程度的检测方法。

背景技术

人类巨细胞病毒(Humancytomegalovirus，HCMV)是一种人群中广泛存在的DNA双链病毒，是一种机会性病原体。在移植患者或其他应用免疫抑制剂的免疫缺陷患者，HCMV感染是最常见的感染。具有免疫力的个体初次感染HCMV通常是无症状的，但在移植患者中感染的严重性与免疫抑制的程度却成正比，HCMV感染是肾移植患者最常见的病毒感染并发症。

移植的实体器官是HCMV感染的主要器官，移植患者HCMV感染所引发的临床症状分两大类：直接效应(单核细胞增多样综合征或组织浸润性疾病)和间接效应，当发生高HCMV血症、免疫组化检测证实病毒感染时，就要高度怀疑HCMV组织浸润性疾病的发生。HCMV感染所致的间接效应是由于长期的病毒低水平复制，经直接的或免疫介导的损伤导致宿主免疫功能紊乱引起的临床征象，包括免疫抑制和移植物排斥，进而影响移植物长期存活。

目前常用荧光定量PCR法扩增血浆、尿液等体液中HCMVDNA水平来监测HCMV病毒载量。国内以10,000拷贝/mL为阈值，高于此值时，认为患者体内有HCMV病毒高水平复制，处于HCMV感染活动期，需要抗病毒治疗。国外则以30,000拷贝/mL为阈值。HCMVDNA拷贝数反映病毒的复制能力，T细胞功能主要反映机体对病毒的清除能力。从患者体液中HCMVDNA拷贝数、T细胞功能等方面来评估HCMV感染对移植患者的危害，由于缺乏HCMV病毒感染对B淋巴细胞免疫功能危害的评估，故而并不能比较全面地反映免疫功能状态。

病毒载量检测建立在病毒复制本身，即使是低水平复制、没有症状，病毒复制仍可直接或间接导致一些并发症，而不仅仅是器官损害。因此有利于指导预防性用药。特异的免疫应答检测建立在发生的并发症和器官损害是与HCMV病相关，而不是HCMV复制，虽然说对于确实需要药物治疗的患者更有效，但是待检测到与HCMV病相关的异常免疫应答时，其实已经处于被动的必须及时治疗的状态。肾移植患者HCMV感染后常常同时伴有非特异性和特异的免疫应答，体现者之一即是B淋巴细胞高反应活性状态。

然而，个体情况不同的肾移植患者在感染同一HCMV病毒情况下，对各自机体造成的危害并不相同。因此，如何很好地评估HCMV感染状态以及对机体造成的危害程度，从而很好地防治HCMV感染是肾移植术后管理的重要目标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种用于模拟检测不同肾移植患者在感染巨细胞病毒后反映CD19⁺B淋巴细胞表型和生物学活性的方法。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种检测肾移植患者在术后感染巨细胞病毒危害程度的方法，包括以下步骤：

a、采血，采集该肾移植患者的肝素钠抗凝外周血20mL；

b、CD19⁺B淋巴细胞的获取及分析，从淋巴细胞分离液中分离单个核细胞，以磁珠分选所述外周血中CD19⁺B淋巴细胞；

c、制备人巨细胞病毒毒种和定量；

d、体外培养CD19⁺B淋巴细胞并对其分别进行HCMV病毒的直接刺激和间接刺激；

e、流式检测在HCMV病毒的直接刺激和间接刺激条件下BAFF受体在所述CD19⁺B淋巴细胞上的表达，并获得检测结果；

f、检测在HCMV病毒的直接刺激和间接刺激条件下CD19⁺B淋巴细胞的凋亡率，并获得检测结果；

g、ELISPOT法检测在HCMV病毒的直接刺激和间接刺激条件下CD19⁺B淋巴细胞分泌IgG的能力，并获得检测结果。

进一步的，所述步骤c中包括以下操作子步骤：

i、用含10％FBS的F12K完全培养基培养人肺成纤维细胞至长满瓶底；

ii、弃培养基，PBS洗两遍，加1mL病毒液，置于37℃、5％CO₂的培养箱中吸附病毒2小时；

iii、弃掉病毒液，加含2％FBS的F12K维持培养基继续培养；

iv、至细胞病变80％以上时收获细胞；

v、-80℃和常温反复冻融3次，382g离心10min取上清，分装并保存至-80℃；

vi、Reed-Muench法测定半数组织培养感染量。

进一步的，所述步骤d中包括以下操作子步骤：