[发明专利]一种抗禽流感病毒转移因子制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种抗禽流感病毒转移因子制备方法。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33％。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车辆往来是传播本病的重要途径。

转移因子(Transferfactor,TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染，也可以通过白介素与干扰素作用于免疫应答过程。畜禽脾脏为加工过程中的废物，因此有着极大的应用前景，已成为转移因子的研究热点。

转移因子含多种成分，分子量小于10000，无热原，无抗原性，无毒副作用，是一种新型而又安全的免疫制剂。转移因子不会被胃蛋白酶、胰蛋白酶分解，也不会被胃酸破坏，可以口服，使用剂量小，起效快，药效持续时间长。转移因子作为具有特异性与非特异性的免疫活性细胞调节因子，可以用于动物病毒性疾病、真菌感染、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤的辅助治疗。目前，常规的制备方法主要是离心、超滤等，容易影响转移因子的活力、回收率低、纯度低。因此，需要一种快速、高效并且成本较低的从动物脾脏中获取转移因子的方法，以满足目前的工业化生产。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种抗禽流感病毒转移因子制备方法。以解决现有技术中相关方法所制备的转移因子活力较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是有技术中相关方法收率较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗禽流感病毒转移因子制备方法，包括以下步骤进行：

1)原材料的制备：取6月龄猪，用禽流感病毒疫苗皮下注射免疫，2周后，再以同样方法及剂量免疫一次；二次免疫后15-20天取猪脾脏；

2)预处理：去除猪脾脏的筋膜和脂肪组织，洗净；

3)破碎：将步骤2)预处理后的猪脾脏剪碎，加入3倍体积的预冷磷酸盐缓冲溶液，用高速组织捣碎机以1000r/min～2000r/min捣碎3～5次，每次5min，制得匀浆液；

4)冻融：将步骤3)所得匀浆液置于-80℃冷冻，而后在22℃～37℃水浴条件下融化，交替冻融5～10次；

5)高压匀浆：向其中加入表面活性剂，利用高压均质机在60MPa条件下进行细胞破碎；

6)提取：向其中加入2～5倍体积的预冷磷酸盐缓冲液，4℃条件下以6500～8000r/min速率离心10min，取上清；

7)凝胶色谱分离：将步骤6)所述上清通过微孔滤膜过滤，而后利用凝胶色谱柱分离，收取6000道尔顿以下的物质，即为粗产物；

8)透析：将步骤7)所得粗产物装入透析袋，于4℃条件下现在0.05MPBS溶液中透析8h～18h，再置于0.01MPBS溶液中透析8h～18h，所得产物即为抗禽流感病毒转移因子。

优选的，步骤7)所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。

优选的，步骤5)所述表面活性剂是聚山梨酯。

优选的，还包括步骤9)：将透析后的产物用孔径为0.22μm的滤膜加压过滤除菌。

优选的，所述抗禽流感病毒转移因子密封保存于4℃条件下。

在以上技术方案中，破壁之前加入表面活性物质，益于破壁，且更彻底；采用先免疫后提取的方法，用禽流感病毒免疫猪，以猪脾脏为原料，得到特异性抗禽流感病毒转移因子。本发明采用了低温反复冻融、化学方法降低细胞膜的稳定性、高压匀浆法、凝胶色谱分离、透析等方法，所得到的目的产物产出率高、纯度好、特异性强，且可制备成口服液或者片剂等，便于应用。

本发明的技术优势主要体现在以下方面：

(1)原材料来源容易，无污染，价廉等优点。猪脾脏和胸腺属于屠宰后猪的下脚料，为废弃物。

(2)本工艺采用先免疫后提取的方法，免疫后在抗体水平最高期宰杀，取脾脏、胸腺等，最终得到特异性抗禽流感病毒转移因子。

(3)在提取转移因子过程中用低温冻融处理，不使小分子物质活性丧失，并能够使禽流感病毒转移因子得以充分的提取。