[发明专利]TOP2A基因表达量荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种人拓扑异构IIα(TOP2A)基因荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。

(二)背景技术

拓扑异构酶(Topoisomerase，TOP)是存在于细胞核内的一类酶，能够催化DNA链的断裂和结合，从而抑制DNA的拓扑状态。哺乳动物主要存在两种拓扑异构酶，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解结合环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化。相反拓扑异构酶II引起瞬间双链酶桥的断裂，然后开通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。拓扑异构酶II又包括TOPIIa和TOPIIβ两种同工酶。TOPIIa的编码基因为TOP2A，位于17ql2.21。TOP2A在快速增殖细胞中含量最高，其表达仅限于S期到G2/M期的细胞周期。TOPIIa在分化差的肿瘤组织中的表达明显高于分化良好的肿瘤组织，在正常组织中则很少表达，这使得它可能成为抗肿瘤治疗的有效靶点。

临床上的拓扑异构酶II抑制剂就是针对该靶点的抗肿瘤药物。拓扑异构酶II抑制剂根据作用方式不同分为嵌入型和非嵌入型两类。嵌入型抑制剂系通过其分子中类似嘌呤碱或嘧啶碱的多环结构嵌入到拓扑异构酶II与DNA结合部位的双链之间，从而干扰了酶将DNA断端重新接合的正常功能，并进一步造成DNA链断裂损伤，导致细胞死亡。这一类药物主要有:吖啶类(m-AMSA)，蒽环类(阿霉素、柔红霉素等)，蒽二酮类(米托蒽醌、蒽双咪腙)。非嵌入性抑制剂的作用模式尚不清楚。

研究表明，TOP2A基因异常对蒽环类药物化疗的疗效有预测作用。有淋巴结转移的乳泉癌患者被随机分成CEF化疗组和CNM化疗组，分析TOP2A和化疗疗效的关系。结果显示，TOP2A基因变异(扩增或缺失)的乳腺癌患者，接受CEF化疗者的RFS(HR＝0.3，P＝0.005)和OS(HR＝0.33，P＝0.008)明显优于CMF组；相反TOP2A基因无变异的患者，CEF和CMF的疗效之间并无无明显的差别。在一项分析5000例乳腺癌者HER-2和TOP2A基因改变与化疗疗效关系的试验中，发现单纯使用AC方案化疗，HER-2和TOP2A基因同时高表达的患者生存明显优于仅有HER-2基因高表达组(P＝0.004)，因此，认为TOP2A基因扩增可预测乳腺癌含蒽环类化疗药物的疗效。对278例乳腺癌患者的研究表明，TOP2A基因表达的乳腺癌患者中pCR率要明显高于TOP2A未表达的患者(P<0.0001)。META分析也同样证明，TOP2A基因扩增可作为乳腺癌含葱环类化疗疗效的预测因子。这些研究结果均提示我们在乳腺癌患者中，TOP2A基因变异与葱环类辅助化疗的作用有一定的关联，可作为药物选择的参考。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种人TOP2A基因荧光定量PCR检测试剂盒，用于检测人TOP2A基因的表达，特异性好，灵敏度高。

本发明采用的技术方案是：

一种检测人TOP2A基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：

上游引物：5’-GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3’

下游引物：5’-AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3’。

所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、反转录缓冲液、PCR缓冲液、Mg²⁺、双蒸水、逆转录酶、Tag酶等，也可直接采用市售PCRMix成品。

所述试剂盒还可包括人TOP2A基因检测标准品，所述标准品序列如下：

5’-AATGTGAGGCGATTATTTTAAGTAATTATCTTACCAAGCCCAAGACTGGTTTTAAAGTTACCTGAAGCTCTTAACTTCCTCCCCTCTGAATTTAGTTTGGGGAAGGTGTTTTTAGTACAAGACATCAAAGTGAAGTAAAGCCCAAGTGTTCTT-3’。

标准品的制备：以Genebank中发布的人TOP2A的基因序列为标准，以健康体检人的外周血mRNA为模板，反转录为cDNA。以该cDNA为模板，用上述引物扩增出特异性的PCR片段，然后把该PCR片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，nanodrop2000测定浓度和纯度，以此质粒作为检测分析中的标准品。

本发明还涉及所述的试剂盒在检测人TOP2A基因表达量中的应用。

具体的，所述应用方法如下：