[发明专利]焦磷酸测序法检测CYP3A4基因分型的引物对及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法检测CYP3A4基因分型的引物对及试剂盒。

背景技术

CYP450酶是一种重要的单氧化酶，在许多内源性及外源性化合物的氧化或还原代谢中起重要作用，包括类固醇、脂肪酸、前列腺素、药物、致癌物质和毒素等。近年来，国外已在人肝微粒体中发现近200种CYP450同工酶，其中，CYP3A4约占成肝CYP450酶总量的25％，它参与了多种环境毒素及其常用化疗药物的代谢反应。

迄今为止，在中国人中已发现的CYP3A4突变等位基因主要为内含子2、内含子10、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*18(其中，CYP3A4*18B与CYP3A4*1G具有同一突变位点20230G>A)和CYP3A4*19。CYP3A4*1G(同CYP3A4*18B)是目前在中国人群中发现的CYP3A4基因突变频率最高的一个位点,有文献报道该突变会提高CYP3A4酶活性。

CYP3A4酶参与多种阿片类药(如芬太尼、阿芬太尼、苏芬太尼、丁丙诺啡及美沙酮等)的代谢。芬太尼静脉给药后主要在肝脏经N-去羟基化生成去甲芬太尼。研究表明，CYP3A4*1G与镇痛药物芬太尼代谢有密切关系，与术后24小时芬太尼静脉镇痛消耗量降低有关。

强效免疫抑制剂他克莫司(FK506)作为临床一线药物，因狭窄的治疗窗和显著的个体差异，必须通过治疗药物监测及时调整用药剂量。FK506在体内主要经CYP3A4及CYP3A5药物代谢酶代谢。编码CYP3A4及CYP3A5酶的基因存在许多单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)，如果这些SNP位点为突变型，将影响患者FK506的代谢过程和疗效。研究发现，CYP3A4*1G位点的基因型与他克莫司血药浓度及使用剂量、不良反应和急性排斥反应相关。因此进行CYP3A4*1G位点的基因分型检测对于实现他克莫司的个性化用药有着非常重要的意义。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测CYP3A4基因分型的产品。

目前，现有技术中，主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序及序列特异性引物PCR等方法检测CYP3A4基因分型，这些方法存在检测结果准确性不高、检测周期长及操作繁琐的缺点，难以满足临床检验的标准要求。

发明内容

为了解决上述方法检测CYP3A4基因分型过程中存在检测结果准确性不高、检测周期长、操作繁琐及难以满足临床检验要求的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的焦磷酸测序法检测CYP3A4基因分型的引物对及试剂盒。

本发明提供了一种焦磷酸测序法检测CYP3A4基因分型的引物对，所述CYP3A4基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述引物对包括：

正向扩增引物：5’-GGAGGAAATTGATGCAGTTTTACC-3’(SEQIDNO.1)；

反向扩增引物：5’-ACGCTTCTGCCAGTAGCAA-3’(SEQIDNO.2)；

测序引物：5’-CCCTCCTTCTCCATGTA-3’(SEQIDNO.3)；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

本发明还提供了一种焦磷酸测序法检测CYP3A4基因分型的试剂盒，所述CYP3A4基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述试剂盒包括：

正向扩增引物：5’-GGAGGAAATTGATGCAGTTTTACC-3’(SEQIDNO.1)；

PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-ACGCTTCTGCCAGTAGCAA-3’(SEQIDNO.2)；