[发明专利]一种用于诊断阴道炎的阴道加德纳菌的试剂盒

说明书

本发明是申请号为201510408127.1、申请日为2015年7月13日、发明名称为“一种用于诊断阴道炎的阴道加德纳菌的试剂盒”的专利的分案申请。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种用于诊断细菌性阴道炎的阴道加德纳菌LAMP检测试剂盒。

背景技术

细菌性阴道炎(bacterialvaginosis，简称BV)是一种以正常的阴道菌群改变为特征的临床症候群。以前由于对其认识有限，曾报道过很多名称，如非特异性阴道炎、加德纳菌性阴道炎、阴道嗜血杆菌性阴道炎等。BV是育龄妇女最常见的阴道感染性疾病，其可引起子宫颈炎、子宫内膜炎等并发症，也使患者感染HIV病毒和早产的风险增加。

阴道加德纳菌(GardnerellaVaginalis)在BV的微生物菌群中占绝对优势，含量明显高于其它非正常菌群，是BV的感染原。其是一种革兰氏染色不定的细小杆菌，属于加德纳菌属，该属仅此一个菌种。该菌常感染性活跃期妇女，部分病情迁延不愈，对妇女健康及公共卫生影响很大。因此对阴道加德纳菌的检测对细菌性阴道炎的临床诊断及治疗非常必要。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP)是日本学者Notomi于2000年建立的一种新型的核酸扩增技术。该技术针对靶基因6个区域设计4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因,产物是两端带有茎环结构的哑铃状DNA分子。与业已成为实验室常规检测的PCR方法相比，LAMP技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在不断的改进和完善过程中被广泛应用于各种病原检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于诊断细菌性阴道炎的阴道加德纳菌LAMP检测试剂盒。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种用于诊断细菌性阴道炎的阴道加德纳菌LAMP检测试剂盒，其包括特异性引物组、反应缓冲液、BstDNA聚合酶和核酸染料，其中所述特异性引物组的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：ACGGGTGGTAATGCTGGA(SEQIDNO:1)

外引物B3：CTGCATGGACCTTACTACTG(SEQIDNO:2)

内引物FIP：TGATAGGACGCGACCCCATCC-CTCCAACTTGACGCATGTCT(SEQIDNO:3)

内引物BIP：TAGGCTTCGACGGGTAGCCG-AGGAGTCTGGGCCGTATC(SEQIDNO:4)。

优选地，所述反应缓冲液由10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mMMgSO₄和5mM甜菜碱组成。

优选地，所述核酸染料为1000×SYBRGreenI。

优选地，本发明的试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。

优选地，所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液，其由100mMTris-HClpH8.0、50mMEDTA、1MNaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH7.0-7.5。

在另一个方面中，本发明还提供一种阴道加德纳菌LAMP检测方法，其包括以下步骤：

(1)向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；

(2)在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP1μl、40pmol/μl的内引物BIP1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的BstDNA聚合酶1μl、模板DNA2μl，加水补充至25μl，并以阴道加德纳菌基因组DNA作为阳性对照，以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作为阴性对照；

(3)将步骤(2)中的PCR管于63℃恒温反应60min；

(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

在另一个方面中，本发明还提供了特异性引物组在制备用于诊断细菌性阴道炎的阴道加德纳菌LAMP试剂盒中的应用，其中所述特异性引物组的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：ACGGGTGGTAATGCTGGA(SEQIDNO:1)