[发明专利]ERCC1基因表达量荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种人ERCC1基因荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。

(二)背景技术

修复交叉互补基因1(Excisionrepaircross-complementing，ERCC1)基因是定位于人类染色体19q13.2-q13.3上的一个长约15Kb的修复基因。ERCC1基因主要分布在细胞核内，但是在一些肿瘤细胞的细胞质中也有表达，且多集中于核膜周围。ERCC1基因含10个外显子，编码的ERCC1蛋白质含有297个氨基酸，是人类细胞DNA损伤后核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair，NER)途径中ERCC基因家族的重要成员。该基因能对核苷酸进行切除和修复以减少DNA的损伤，是核苷酸切除修复通路活性的标志性基因。ERCC1基因与XpF/ERCC4形成异源二聚体而发挥功能，该二聚体有5’DNA核酸内切酶活性，具有损伤识别和切除DNA5’端的作用，能够修复紫外线、多种化学物质所造成的损伤，是细胞活性必须的DNA修复基因。

ERCC1是NER途径中具有特异性的重要组成部分，它的存在对生命至关重要。它的缺失或突变，会使机体生理功能遭受破坏，正常发育受阻，基因不稳定性增加，甚至导致机体死亡。功能性ERCC1为生命所必需，它在正常成长、大脑发育、免疫转化等方面均具有一定的功能。ERCC1敲除的小鼠出生时表现为严重的发育不良，断奶前死于肝细胞多倍体表型增加所致的肝衰竭；将ERCC1定向导入ERCC1缺失小鼠的肝脏可减轻这种发育不全，延长其寿命，并且可以逆转原来的DNA氧化损伤和早熟的肝脏多倍体表型，恢复肝脏功能。但随之观察到了其它组织的异常如广泛的线粒体功能障碍、肾脏近端小管的多倍体型变异，提示可能是由于ERCC1缺失的动物不能修复这些组织的累积性、内源性DNA损伤所致。ERCC1的修复功能在雄雌性动物干细胞的整个成熟过程中也是必需的：ERCC1缺失的雄雌性小鼠均丧失生育能力，在ERCC1缺失小鼠的翠丸中DNA链断裂及DNA氧化损伤增加，而且雄性干细胞的凋亡也增加。另外，ERCC1缺陷小鼠对造血系统应激的反应性降低，造血干细胞的活性易耗竭，呈现出一种早老状态。

修复基因的表达水平和修复活性密切相关。缺失ERCC1基因的细胞，修复紫外线引起的嘧啶二聚体能力下降，容易秀发细胞的凋亡。临床研究显示恶性肿瘤组织中ERCC1基因表达处于下调状态，其低表达可增加肿瘤的遗传易感性。研究表明，ERCC1基因低表达是发生头颈部肿瘤的高危因素。但是，在肠腺瘤与结肠癌组织中，ERCC1的表达量高于正常组织，ERCC1表达升高被认为是结肠癌和腺瘤的早期阶段。非小细胞肺癌(NSCLC)患者ERCC1阳性率为50.94％，而肺鳞癌的ERCC1的表达率为29％，肺腺癌为57％，鳞腺混合型癌为60％。虽然ERCC1作用机制尚不能完全明确，更有待进一步的研究。但是，ERCC1作为NER通路中的一个关键基因，在DNA的损伤修复中占有重要地位，其表达与肿瘤发生的易感性密切相关。

顺铂、卡铂和奥沙利铂等铂类药物是一线肿瘤化疗药物，广泛应用与非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、恶性淋巴瘤、原发性肝癌等的肿瘤治疗。铂类药物可以和DNA形成铂-DNA加合物，使增值迅速的细胞停滞在G2/M期，影响细胞DNA的复制与转录，从而导致DNA损伤。肿瘤细胞最终的命运取决于凋亡程序和DNA损伤修复程序的强弱。若DNA修复功能弱，肿瘤细胞凋亡；反之，细胞将继续存活并产生对铂类药物的耐药性。肿瘤细胞对铂类药物耐药性的产生是铂类药物应用的最大“瓶颈”。核苷酸切除修复能力与铂类药物的耐药密切相关。ERCC1的高表达，可使处于停滞在G2/M期的损伤DNA双链结构迅速修复，进而导致肿瘤细胞对铂类药物耐药。在2012年版《非小细胞肺癌临床实践指南》(NCCNClinicalPracticeGuidelinesinOncologyforNSCLC.V12012MS-7)中明确提出ERCC1水平可用于预测含铂类化疗治疗NSCLC的疗效；高水平者耐药，低水平者敏感。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种人ERCC1基因荧光定量PCR检测试剂盒，用于检测人ERCC1基因的表达，特异性好，灵敏度高。

本发明采用的技术方案是：

一种检测人ERCC1基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：

上游引物：5’-TGACCACCGTGAAGTCAGTC-3’