[发明专利]一种质粒DNA规模化纯化方法

权利要求书

1.一种质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为0.2～2mol/L，过夜沉淀后，用50～500目纱网过滤裂解液，然后再用10～100μm囊式滤器过滤裂解液；

2)将步骤1)过滤后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵循环，而后经0.22～0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

3)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01MPBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第一洗滤液待用；

4)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01MPBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第二洗滤液待用；

5)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01MPBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第三洗滤液待用；

6)将步骤2)所述透过液、步骤3)所述第一洗滤液、步骤4)所述第二洗滤液、步骤5)所述第三洗滤液混合均匀，得到混合液；

7)将步骤6)得到的混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵循环，而后经100～500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA裂解液；

8)以1:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA裂解液；

9)以1:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA裂解液；

10)以1:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA裂解液浓缩液；

11)在步骤10)得到的DNA裂解液浓缩液中加入终浓度0.5～2％(W/V)的TritonX-114，涡旋振荡后置于冰浴中10～40min；

12)将步骤11)处理后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵循环，而后经0.1～0.45μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

13)将步骤12)得到的透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入4倍体积的0.01MPBS，开启循环泵循环，经100～500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA纯化液；

14)以2:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA纯化液；

15)以2:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA纯化液；

16)以2:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA纯化液；

17)将步骤16)得到质粒DNA纯化液，用0.22μm囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品。

2.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤1)所述的加入的氯化钙，使终浓度为2mol/L。

3.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤1)所述的纱网孔径为200目，囊式滤器的孔径为30μm。

4.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45μm。

5.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。

6.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤11)所述的加入的TritonX-114，使终浓度为1.5％(W/V)。

7.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤11)所述的冰浴时间为30min。