[发明专利]冻存脐血细胞诱导DC-CIK 细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DC-CIK细胞联合制备方法，特别涉及一种冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法。

背景技术

1973年Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞(dendriticcells，DCs)。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。

CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1％—5％。目前国内外制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞，实际上是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群以CD3+、CD56+、CD8+为主的异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的重要方案。

CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合使用可确保高效的免疫反应。

现有技术中，采用健康人外周血进行诱导培养DC-CIK，由于外周血中的造血干细胞较少，致使其诱导效率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导和富集过程简单易行、周期短、成本低廉、诱导效率高、富集后细胞活力好的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，包括以下步骤：

(1)复苏冻存脐血细胞，在培养瓶中进行贴壁培养；

(2)DC细胞制备：反复吹打步骤(1)中的培养瓶壁，得到DC贴壁细胞，收取悬浮细胞移入另一培养瓶中做CIK细胞培养备用，在DC细胞完全培养基加入GM-CSF和IL-4后添加至具有DC贴壁细胞的培养瓶中进行培养，获得DC细胞；

(3)CIK细胞制备：将收集步骤(2)的悬浮细胞调整密度，加入IFN-Y，培养20～24小时后，加入IL-2、IL-1a、和CD3MAb，进行细胞培养，获得CIK细胞。

本发明的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法的冻存脐血具有较多的造血干细胞，以及采用多细胞诱导因子，使本方法具有诱导效率高、重复性好、富集后细胞活力好的特点。本方法操作步骤简单，使诱导和富集过程简单易行、周期短、成本低廉。

在一些实施方式中，在步骤(2)中，反复吹打培养瓶壁收取悬浮细胞后，向培养瓶加入GT-T515无血清培养基，再次反复吹打瓶壁收取悬浮细胞，重复上述操作，直至在显微镜下能够清晰观察DC贴壁细胞。

在一些实施方式中，在步骤(2)中，DC细胞培养8～14天，细胞培养第一天添加因子IFN-Y至终浓度1000IU/ml。

在一些实施方式中，在收取DC细胞前添加肿瘤抗原至终浓度50ng/ml，

在步骤(2)中，DC细胞培养第4天进行2/3换液，补液中GM-CSF终浓度为1000IU/ml、IL-4终浓度为500IU/ml。

在一些实施方式中，在步骤(2)DC细胞培养过程中，若培养液变橙黄色则按原培养液体积25％补液，补液中GM-CSF终浓度为1000IU/ml、IL-4终浓度为500IU/ml。

在一些实施方式中，在步骤(3)中调整悬浮细胞密度最低密度调整为10⁸个/ml。

在一些实施方式中，在步骤(3)中，CIK细胞培养12～16天，细胞培养第一天添加因子IFN-Y至终浓度1000IU/ml，细胞培养第二天添加因子IL-2至终浓度为1000IU/ml，IL-1a至终浓度为500IU/ml，CD3MAb至终浓度为375ng/ml。

在一些实施方式中，在步骤(3)CIK细胞培养过程中，若培养液变橙黄色则按原培养液体积20％补液，补液中IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-1a终浓度为500IU/ml，CD3MAb终浓度为375ng/ml。