[发明专利]二化螟致死基因csu-miR-260及其应用

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及二化螟致死基因csu-miR-260及其应用。

背景技术

二化螟Chilosuppressalis(Walker)属鳞翅目，螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一。在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致二化螟对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。

microRNAs(miRNAs)是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，从而在转录后水平调控生物的生长、发育、代谢。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程中起多种调节作用。

在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用miRNA类似物将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。

发明内容

本发明的目的利用小RNA文库(smallRNAlibrary)分析发现具有致死效果的csu-miR-260。

本发明的另一目的是提供该miRNA的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

灰飞虱致死基因csu-miR-260，序列为5’-UUUUGGAUGACUGGCCCAUGUCGGCGU-3’。

所述的csu-miR-260是通过以下生物信息学方法分析发现的：

(1)去除被污染的序列与无义序列，过滤掉短于18nt的序列，得到可标注的干净数据；

(2)使用Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行序列比对，使用Rfam(http://rfam.sanger.ac.uk)去除正义外显子、反义外显子、正义内含子、反义内含子、rRNA、tRNA等。使用RepBase(www.girinst.org/repbase)去除重复序列；

(3)在已知二化螟基因组(http://ento.njau.edu.cn/ChiloDB/)的情况下，使用miRDeep预测miRNA。先用MegaBlast(http://www.mega-blast.com/)将处理后的小RNA文库序列映射到基因组上，再使用miRDeep，以默认参数进行miRNA预测；

(4)为了分析miRNA的家族与保守性，我们使用Patscan，以211参数将二化螟成熟体miRNA与miRBaseversion19.0上的已知miRNA进行比对，最终获得csu-miR-260。

本发明所述的csu-miR-260在制备二化螟灭虫试剂中的应用。

一种二化螟灭虫方法，用所述的csu-miR-260的溶液在二化螟幼虫的上背部或侧面进行注射或使用所述的csu-miR-260喂食二化螟。

所述的灭虫方法，优选包含以下步骤：

(1)用无核酸酶水稀释所述的csu-miR-260至浓度为200pmol/μL；

(2)选取合适天数的二化螟幼虫，在上背部或侧面，使用微量注射器注射0.5μL/头csu-miR-260溶液；

(3)用针头挑起虫体，等待一段时间，待csu-miR-260已混入幼虫血腔，轻轻拔出针头。

有益效果：

本发明阐述了完整的miRNA生物信息学分析，从海量的小RNA文库数据中搜寻到一条有效miRNA——csu-miR-260。

利用体外合成的csu-miR-260注射二化螟，对二化螟具有明显的致死效果，说明该miRNA基因可作为二化螟重要基因的有效干扰物。

本发明合成的csu-miR-260能有效抑制二化螟体内重要基因的表达，更好地抵抗RNA酶的降解，同时合成成本较低，便于大量实验使用。

附图说明

图1csu-miR-260注射实验致死率统计图。

具体实施方式

实施例1

(1)化学合成二化螟致死基因csu-miR-260，序列为5’-UUUUGGAUGACUGGCCCAUGUCGGCGU-3’(SEQIDNO.1)；