[发明专利]pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶EG5AP1及其编码基因和应用。

背景技术

β-葡聚糖广泛存在于大麦、小麦、黑麦，燕麦，水稻和高粱等谷类经济作物的糊粉层和胚乳细胞壁中，属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，具有线型的空间结构。β-葡聚糖是由D型葡萄糖以不同比例的β-1,3和β-1,4糖苷键连接而形成的长链多糖聚合物。β-葡聚糖链通过分子内和分子间氢键的紧密排列形成不可溶的纤维素微丝。

β-内切葡聚糖酶是纤维素酶系中的一个重要组成部分，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子降解产生小分子葡聚糖或葡萄糖。β-葡聚糖酶在工业中的应用十分广泛，如啤酒酿造、动物饲料添加及食品加工等。其中酸性葡聚糖酶主要应用于饲料行业，β-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内吸收较多的水分后，具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜充分接触，从而影响营养物质的吸收，成为一种抗营养因子。动物饲料中添加β-葡聚糖酶可以帮助动物分解麦类成份(大麦、小麦及燕麦)，提高饲料中营养物质的利用率，促进动物的消化吸收和生长发育。

在饲料工业中，动物胃肠道是酸性环境，而且在饲料的加工过程中，有一个短时的高温过程，因此研究挖掘耐高温、耐酸碱及高比活的酶将具有更高的商业价值及竞争性。而自然界分离得到的酶很难满足工业需求，因此通过分子改良的方法，理性设计提高酶的稳定性是目前学术及产业界持续努力的目标。5家族内切葡聚糖酶EG5AP1是一种高温酸性酶，最适温度75℃，最适pH5.0，不具备胃蛋白酶抗性，但其应用于饲料行业中时需要在酸性(pH2.0)条件下具有高酶活且能保持稳定，具有胃蛋白酶抗性。为了使其更好地应用于饲料行业，需要对该酶进行分子工程改造，以提高其嗜酸、耐酸性质，从而具备胃蛋白酶抗性。本发明通过定点突变的方法设计突变体来改良EG5AP1的pH稳定性及热稳定性，进而有效地提高其在工业上的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶EG5AP1。

本发明的再一目的是提供编码上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的应用。

本发明对内切葡聚糖酶EG5AP1(其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)进行定点突变，分别将177、261、288、333位谷氨酰胺突变为谷氨酸。

内切葡聚糖酶EG5AP1氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：

MKASTIICALLPLALAVPNARRASGFVCMFPFLLFIAEADGEIGFGSNESGAEFGETKLPGVLGTDYIWPDASTIKTLHDAGMNIFRVAFRMERLIPDKMTGTPDATYMNDLKATVNAITSLGAYAVIDPHNYGRYYGNIISSTDDFAAFWKTVAAQFASNDHVIFDTNNEYHDMDETLVLNLNQAAINAIRAAGATSQYIFVEGNSWSGAWTWTNVNDNLKALTDPQDKIVYEMHQYLDSDGSGTSATCVSSTIGQERVQSATQWLKTNGKKGIIGEFAGGPNSVCQSAVTGMLDYLSANSDVWMGAAWWAAGPWWADYMFSMEPPSGTGYQNYLSLLKPYFVGGSGGNPPTTTTTTTSKPTTTTTTAGNPGGTGVAQHWGQCGGIGWKGPTACATPYTCQKLNDYYSQCL

内切葡聚糖酶EG5AP1的基因序列如SEQIDNO.2所示：