[发明专利]抗蓝舌病病毒NS3蛋白的单克隆抗体BTV-NS3-3D8及其识别的B细胞表位和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗蓝舌病病毒1～24型NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及一个B细胞表位，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的蓝舌病病毒1～24型NS3蛋白的B细胞表位；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位在研究蓝舌病病毒NS3蛋白结构和功能以及在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒1～24型感染的试剂与药物中的应用，本发明属于蓝舌病的防治领域。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的成员蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起的，经由其传播媒介库蠓通过吸血途径在反刍动物之间进行广泛传播的虫媒性急性、烈性动物传染病。其易感动物主要有面绵羊、山羊、水牛、黄牛、鹿、骆驼等反刍动物，其中绵羊、山羊最易感。通常只有绵羊被感染后才表现出明显典型的发病症状，其主要表现为：体温升高至40.5-41.4摄氏度；口腔黏膜发绀充血；嘴唇、眼睑、面部水肿；大量流涎、呕吐、下痢。蓝舌病发病急，传染性较强，造成反刍动物的高死亡率，对大动物养殖业以及动物经济市场造成了严重的损失。所以我国将蓝舌病划规为一类疫病，世界动物卫生组织将其列为须通报动物疫病。由于传播媒介库蠓生活的季节性和地域性，所以蓝舌病主要分布于非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲的多个热带、亚热带和温带地区国家。蓝舌病最早于18世纪被发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热后出现口腔黏膜损失以及舌头发蓝，蓝舌病因此而得名。1940年前本病还仅发现于撒哈拉以南的非洲大陆，比如埃及(1907年)、肯尼亚(1909年)、西非(1927年)、塞浦路斯、巴勒斯坦、土耳其、叙利亚(1943-1949年)。

而后，欧洲、美洲及亚洲都相继报道该病的爆发。而我国是在1979年在云南省师宗县首次分离出蓝舌病病毒，而报道蓝舌病在中国的爆发，之后在湖北省(1983年)、安徽省(1985年)、四川省(1989年)、山西省(1991年)相继爆发此病。有关学者通过对我国多个省区蓝舌病血清型进行分析调查，结果鉴定出BTV-1、2、3、4、12、15以及16血清型。我国流行的蓝舌病血清型即为BTV-1、2、3、4、12、15以及16型。进入21世纪以来，在全球温室效应的催化作用下，蓝舌病传播媒介库蠓也广泛地活跃于相关地区，蓝舌病也以流行范围更广、发生频率越大、并且毒力更强的趋势爆发于世界各地。但是由于蓝舌病病毒血清型众多，且基因容易发生漂移等特征，使得目前并没有统一有效确实的治疗措施来预防或是治疗蓝舌病，所以制备出针对某一特定血清型的蓝舌病病毒相关试剂刻不容缓，我们应当未雨绸缪通过储备好相关试剂，以更快、更有效地方式抵御蓝舌病的侵害，最大化地减少畜牧业的经济损失以及保卫公共卫生安全。

蓝舌病病毒(BTV)属于呼肠孤病毒科环状病毒属的成员，是呼肠孤病毒科中最大的一类病毒。其病毒粒子呈20面体对称，病毒粒子直径为70-80nm，无囊膜，基因组为10个分节段大小不等的双股RNA，分别编码7个结构蛋白VP1～VP7和四种非结构蛋白NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4。病毒粒子外层衣壳由VP2和VP5构成，大约占病毒总蛋白的40％；核衣壳由VP3和VP7以及三种次要结构蛋白VP1、VP4、VP6共同构成。病毒基因组包含在病毒双层衣壳中。四种非结构蛋白NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4在病毒复制、组装过程中不构成病毒的组分。其中，NS3/NS3a是由S10基因所编码的，不同血清型的S10基因保守性相当高，对NCBI中不同血清型S10基因进行序列对比发现其序列相似度高达94％_～95％。BTV不同血清型的S10基因长度均为822bp，具有两个开放阅读框，分别编码NS3蛋白和NS3a蛋白，NS3蛋白长度为230个氨基酸残基(aminoacidresidue,aa)，NS3a蛋白长度为219个氨基酸残基(aa)，即NS3a与NS3相比少了N端的13个aa。目前，对于NS3蛋白结构和功能的研究还并不透彻，其生物学功能还尚未被定论，有关学者认为NS3蛋白的主要生物学功能可能与病毒的释放有关，而其作用的机制也仍然处于探索阶段。BTV有26个血清型。由于S10基因及NS3蛋白的高度保守性，我们推测抗BTV15-NS3蛋白的单克隆抗体仍然能与BTV其他血清型之间的NS3蛋白发生反应。所以，本发明针对BTV15-NS3蛋白制备的杂交瘤细胞以及相应的单克隆抗体及其B细胞抗原表位对于建立BTV群特异性的快速鉴别诊断以及为BTV释放等相关基础研究中的应用奠定了基础。

发明内容