[发明专利]一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

SPA、SPG、PPL都是典型的免疫球蛋白结合蛋白，可以与人和多种动物免疫球蛋白结合，结合能力和结合谱不同。SpA，SpG和PPL的单结构域已被证实有结合Ig的作用(JanssonBirger,UhlénMathias,NygrenPer.AllindividualdomainsofstaphylococcalproteinAshowFabbinding[J].FEMSImmunology&MedicalMicrobiology,2006,20(1)。先前报道认为SPA只能结合鼠IgG的Fc区域，SPG既能结合Fc区域又能结合Fab区域，并且认为SPA、SPG与Fc的结合位点是重叠的。但是Aybay,C等用木瓜蛋白酶消化鼠IgG后发现两种蛋白结合Fc区域的结合位点是独立的，并不重叠(AybayC.DifferentialbindingcharacteristicsofproteinGandproteinAforFcfragmentsofpapain-digestedmouseIgG[J].IMMUNOLOGYLETTERS,2003,85(PIIS0165-2478(02)00262-63):231-235.)。SPA、SPG与免疫球蛋白的重链结合，相反PPL只与多种哺乳动物Igκ轻链结合，而且只与片段区域的可变区的VκI、VκIII、和VκIV亚基结合而不与重链、Igλ轻链和κ链的C_L区域结合。PPL与人IgA1、A2、D、E、M亚型和大鼠IgG1的结合能力是SPA、SPG所无法比拟的。PPL有5个同源性Ig结合区域(B1-B5)每个区域有72-76个残基。尽管B1结构域初始残基有些无序，它的C末端62个残基形成一个非常牢固的区域(Tm≈70℃)，由一个a螺旋贯穿四个β折叠构成。

根据SPA、SPA、PPL的免疫球蛋白结合区域的特性与互补性，早在1994就有学者选择L蛋白4个重复结构域B1-B4和蛋白G两个IgGFc结合结构域，构建融合蛋白LG，并用来纯化鼠科动物的IgG和IgG片段的单克隆抗体(GSvenssonH.,RHoogenboomH.,U.ProteinLA,anovelhybridproteinwithuniquesingle-chainFvantibody-andFab-bindingproperties.[J].EuropeanJournalofBiochemistry,1999,258(2))，这些融合蛋白高效而且通用，可以作为强有力的结合介质，用来鉴定、纯化抗体和抗体片段。但并未证实融合后的结构域是如何发挥作用，是协同作用还是抑制作用。2008年Yanghua构建了两种单结构域融合的新型免疫球蛋白结合分子PA(A)-PG和PA(A)-PL，对hIgG/hIgG1-Fc和hIgM/hIgA展现出很强的结合能力，经竞争性抑制试验证实PA(A)-PG和PA(A)-PL分子发挥协同结合的优势和结合性能(HuaYang,JieCao,Lian-QingLietal.Evolutionalselectionofacombinatorialphagelibrarydisplayingrandomly-rearrangedvarioussingledomainsofimmunoglobulin(Ig)-bindingproteins(IBPs)withfourkindsofIgmolecules[J].BMCMicrobiology,2008,8(1))。

本发明选金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3结构域进行基因优化设计，把三种蛋白结构域串联，形成多种拷贝，在大肠杆菌中实现可溶性高效表达，选择表达量高与免疫球蛋白结合能力强的2拷贝体进行酶标记。标记产物经Western-blot、ELISA检测，可与多物哺乳动物免疫球蛋白结合，可作为血清学检测中通用抗体，可替代单一抗体，进行多物种布鲁氏菌检测。改善的AGL-ELISA可检测口蹄疫感染，并能鉴别疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒，该试剂盒可检测多种动物口蹄疫感染，并能鉴别诊断出疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物；