[发明专利]一种同时检测10种虫媒病病原的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种同时检测10种虫媒病病原的试剂盒及其应用，属于液相芯片检测技术领域。本发明的试剂盒含有针对10种常见虫媒病病原的特异性引物和与荧光标记微球偶联的探针，特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑20所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21‑30所示。本发明试剂盒通过设置多重不对称PCR体系，优化杂交反应条件，实现了对10种虫媒病病原的准确检测。本发明的试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，适合口岸检验检疫及虫媒病流行病学调查，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及液相芯片检测技术领域，特别是涉及用液相芯片的方法同时检测10种虫媒病病原的方法和检测试剂盒及其应用。

背景技术

虫媒病是指以吸血的节肢动物作为媒介通过叮咬感染造成人和人、人和动物间传播的一种疾病。动物临床表现为突然发热、感觉酸疼无力、大面积皮疹、继发性感染造成死亡等。该病过去曾使成千上万的人畜感染甚至死亡，给经济和人类社会发展带来了一定的负面影响。20世纪中叶后，随着全球往来加强，也促进了国际动物贸易不断发展，特别是现代化交通工具的使用缩短了世界各地的距离，这些因素为虫媒病的远距离传播和在全球范围内扩大流行的趋势提供了更广泛的可能性。目前，随着国际交往的日益频繁，蚊、蜱、蠓等媒介传入我国边境口岸的风险非常大，虫媒性动物疫病的爆发也有可能随生物虫媒传入我国。

现已知道有100多种虫媒病毒可使动物和人类产生疫病，甚至导致死亡。最有代表性的包括：蚊媒病：水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)、西尼罗热(West Nile，WN)、裂谷热(Rift Valley Fever，RVF)；蜱媒病：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)、莱姆病(Lyme disease，病原为伯氏疏螺旋体，简称BB)、Q热(Q Fever，病原为贝氏柯克斯体，也叫立克次体)；蠓媒病：蓝舌病(Blue tongue，BT)和鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagicdisease of deer，EHD)，施马伦贝格病(Schmallenberg，SB)。这些动物疫病近年来在周边国家的暴发流行已对我国形成威胁，尤其在2014年2月开始爆发于西非的埃博拉出血热(EBola)疫情，造成大量的人员发热出血，严重的甚至死亡。因此，提供虫媒性动物疫病病原检测方法，尤其是能够同时检测多种虫媒病病原的方法具有重要意义。然而现有技术还没有针对上述10种虫媒病病原实现同时检测，为保障我国农业、卫生、社会安全绿色发展，有必要研发一种同时检测上述虫媒病病原的快速、特异、高效灵敏的方法。

液相芯片称为微球体悬浮芯片(suspension array，liquid chip)，是基于xMAP(flexible Multi Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体、酶、底物、配体、受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。

液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色(固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码)。应用时，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入微量待检测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。