[发明专利]一种具有化学修饰基团的蛋白质及其制备方法

说明书

本发明涉及利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质C‑端的技术。具体地，本发明提供了利用蛋白质反式剪接技术将聚乙二醇(PEG)修饰到粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α 2b(IFN α2b)、白细胞介素‑15(ILK‑15)和尿酸氧化酶(UOX)C端的技术，以及提供了制备上述定点C‑端修饰的药物的方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。

技术领域

本发明涉及蛋白质药物修饰领域。本发明涉及利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质C-端的技术。还提供了制备多种聚乙二醇化药物，以及制备方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。

背景技术

聚乙二醇(PEG)化学修饰是延长蛋白多肽类药物在体内半衰期的一个有效途径。修饰了聚乙二醇的蛋白质的构象、静电吸附和亲疏水性等物理化学性质会发生变化。这些物理和化学的变化使聚乙二醇化的药物蛋白质明显优于普通的蛋白质多肽类药物。聚乙二醇化的蛋白质多肽类药物的优点主要体现在：增加了药物溶解性，提高了药物稳定性，降低了免疫原性，减少肾的过滤作用和有效的保护蛋白质多肽药物免遭蛋白水解酶将其分解。

在聚乙二醇化的过程中，最大的技术挑战之一就是特异性。在很多情况下要求将聚乙二醇修饰到蛋白的特定位点，而且修饰后聚乙二醇分子和蛋白质的分子比例应该为1：1。然而，在蛋白质分子中通常会出现多个修饰位点(-SH,-NH2等)，由于是随机修饰，修饰的位点不均一，修饰聚乙二醇的数目也不均一，导致PEG修饰产物是混合物。而且，这些异构体的生物活性也不相同，导致规模化制备时难以实现批次间的稳定性，有时难以达到药物生产和新药申报的要求。

为了解决这个问题，目前有些研究做了定点修饰方面的研究。例如，有些方法是蛋白质N-末端的聚乙二醇修饰(例如美国专利NO.6077939；美国专利NO.7090835；美国专利NO.5621039)。此外，还有一种方法是像蛋白质药物中引入游离的半胱氨酸，用来进行定点修饰(美国专利NO.7214779)。还有一种方法是向蛋白质中引入非天然氨基酸，作为定点修饰的位点(美国专利NO.7230068)。

然而这些方法都有局限性，例如，这些方法的步骤复杂，费时费力。而且修饰效率很低，降低了药物蛋白的活性(蛋白没有正确折叠)。同时，这些方法还会产生副产物，这样会导致药物的活性受影响，去除这些副产物的工作也同样巨大。而且为了优化这些过程，可能要突变一些氨基酸作为多聚物的靶点。然而，突变的氨基酸可能会导致药物多肽丧失活性(例如，二级结构和蛋白构象的变化)。

所以，需要一种新型的定点修饰方法用来克服上述困难。基于蛋白质反式剪接技术，本发明提供了一种定点修饰蛋白质C-末端的技术。蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)是由蛋白质内含子(intein)介导。蛋白质内含子是具有自我催化活性的蛋白质，翻译后，蛋白质内含子片段会从蛋白质前体中剪掉，并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)，形成成熟蛋白质。断裂蛋白质内含子(split intein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂，形成N端片段(IN，N part of intein)和C端片段(IC,C part ofintein)，这种内含子可以结合重构形成有功能的蛋白质内含子，也可以催化蛋白分子间的反式剪接反应。此外，蛋白质反式剪接不但可以在生理条件下进行，而且可以在蛋白浓度相对较低的情况下进行。反式剪接为蛋白质特异位点修饰提供了一种新方法。

发明内容