[发明专利]靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建

说明书

本发明涉及靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体及其构建，是构建了针对小鼠神经干细胞UCP2基因的重组慢病毒载体pNL‑EGFP/CMV/WPREdU3‑sh mUCP2，再以所述重组慢病毒载体联合第二代慢病毒包装质粒pCD/NL‑BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR‑G共转染293T细胞，获得所述包装的重组慢病毒载体。以本发明获得的重组慢病毒载体转染小鼠原代神经干细胞，能高效特异性抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达，为有关小鼠UCP2基因的进一步功能研究奠定良好的实验基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种针对小鼠神经干细胞UCP2基因的RNAi重组慢病毒表达载体，以及该表达载体的构建。本发明所述重组慢病毒可应用于神经管畸形发病机制的研究中。

背景技术

神经管畸形(Neural Tube Defects，NTDs)是指以中枢神经系统为主要发病部位的先天性出生缺陷疾病，我国山西省发病率最高，统计结果高达19.9‰。NTDs的高发现象，成为全球许多国家和地区婴儿终生残疾与死亡的主要原因。

神经管的关闭过程受到基因的严格控制以及环境因素调节。根据申请者近年的研究结果以及文献检索，解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)与神经管畸形的关系在人群调查研究中已经得出了初步相关结论，提示UCP2基因为NTDs的候选基因。基于上述结论，申请者欲利用小鼠神经干细胞(更接近于早期胚胎神经管细胞)证明UCP2与NTDs发生之间的联系，及探索其引起神经管畸形的机制。神经干细胞是一种利用常规方法难于转染的细胞，因此急需利用一种转染效率更高的方法来满足后续实验的研究。上述技术平台的建立，将提供一个UCP2基因功能研究模型，并在后续机制研究中发挥重要作用。但目前对于小鼠神经干细胞UCP2基因的siRNA还未见研究报道。

RNA干扰(RNAi)是利用双链RNA高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使目的基因mRNA降解而发生基因沉默的过程。RNAi在起始阶段，以各种方式(电转、病毒感染等)引入的双链RNA(dsRNA)被Dicer酶逐步切割为21～23nt的小分子干扰RNA片段(siRNA)。siRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，RISC中siRNA变性，正义链脱离，反义链仍结合在复合物上并引导RISC与同源靶目标RNA结合，诱导靶mRNA降解，从而阻断基因表达。siRNA还可以作为一种特殊的引物，在RNA依赖的RNA聚合酶作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可以进入上述循环。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成新的siRNA，使靶mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。

siRNA是RNA干扰的主要效应物。至今哺乳动物细胞RNAi技术路线可以通过两种方式进行：1) 直接制备21～23nt的siRNA片段，将siRNA转入哺乳动物细胞。2) 将短发夹结构RNA(shRNA)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA。前者不适于长时间的研究项目，而后者可持续较长时间，有利于后续的实验开展。

RNAi抑制基因表达作用在很大程度上受到转染方式、转染效率的限制，解决问题的关键是选择合适的载体导入细胞。目前siRNA的导入方式有三种，1) 化学合成siRNAs转染干扰，2) shRNA表达载体法，3) 病毒载体法。前两种方法感染效率低，尤其是针对脂质体干扰效果差的细胞，如神经干细胞。

慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，目前被广泛应用于表达RNAi的研究中。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA。