[发明专利]硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途

说明书

本发明公开了一种硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。该连接单元的结构式为：其中R＝OH或者COOH；R₁＝R₂＝甲基，或R₁＝苯基、对甲氧基苯基、2，4，6‑三甲氧基苯基、萘基或对甲氧基萘基，R₂＝H，或R₁、R₂共同构成环己基、环戊基。该连接单元与核苷酸及荧光素连接得到的荧光素标记核苷酸可用于DNA测序。与现有技术相比，本发明合成的基于硫代缩酮结构的连接单元的可逆终止剂用于DNA测序时，其延伸效率接近100％，并且在模板为连续多个相同碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

技术领域

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA测序的连接单元，具体涉及一种硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量待测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终止剂”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3′-羟基阻断外，为了不影响下一个标记核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个标记核苷酸并入之前，在温和条件下使这个连接单元断裂，然后继续DNA链延伸，完成一次测序循环，从而读出DNA的碱基序列。而连接单元对合成法测序的读长和效率有极其重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，以提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而硫代缩酮连接单元却从来没有用于DNA测序。

可裂解连接单元的性质对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。发明人在前期工作中，发展了一类酸敏感连接单元(201110331659.1，201210132695.X，201310015235.3，201410186697.6，201410203327.9，201510401611.1)以及还原敏感连接单元(201310462509.3，201310401580.0，201410692943.5，201510031230.9，201510388164.0)在DNA测序中的应用。

基于酸敏感连接单元的可逆终止剂用于DNA测序时，不可避免地在一定程度上对DNA链造成损伤，基于偶氮连接单元的可逆终止剂断裂后残留在DNA链上的分子痕较大，在一定程度上影响了下一个可逆终止剂的延伸效率；而基于硫代缩酮结构的连接单元在一定程度上能够克服上述缺点，所以有望在DNA测序领域带来新的机遇。

发明内容