[发明专利]一种大分子量透明质酸的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，具体涉及从高原鼢鼠中提取纯化透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronicacid，HA)，是一种独特的线性大分子酸性粘多糖，实则为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸。对不同组织来源的HA进行的结构测定表明，其结构均一致，没有种属差异，只存在相对分子量的不同。HA广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中，在眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中含量较高。HA是理想的天然保湿因子，广泛用于化妆品中，对防止皮肤老化和保护皮肤的触觉和外观都具有重要作用。由于生物相容性好，HA还是现代眼科手术中的理想原料。此外，HA还可以作为透皮保湿成分，用于关节炎的治疗。

现代研究也发现，不同分子量的透明质酸渗入肌肤的能力不同，所带来的功效也有所不同：如，大分子量1800000～2200000防止脱水，组织细胞再生，紧致肌肤；中分子量1000000～1800000紧致肌肤，长久保湿；小分子量400000～1000000快速与细胞发生水合作用，保持细胞水分含量。相对于中小分子量的透明质酸而言，大分子量的透明质酸对肌肤的保护能力更佳，其市场价值也相对较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大分子量透明质酸的提取纯化方法。天然的大分子量透明质酸存在于哪些动物体内，目前还未有系统的研究，因此，若希望能够提取纯化大分子量透明质酸，则需要找到含有此类透明质酸的动物。发明人意外地发现，高原鼢鼠所含透明质酸满足本发明的发明目的，可以作为本发明的原料。目前还未见有对高原鼢鼠中透明质酸分离鉴定和提取纯化的研究。

基于发明人的上述发现，本发明提供了一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，它包括如下操作步骤：

(1)粗提：取高原鼢鼠，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分绞碎，即为原料；以液料比(3.5～4.5)∶1ml/g加入蒸馏水，再加入原料重量1.0～2.0％EDTA-Na₂和10.0～12.0％NaCl，在组织捣碎机内以10000～12000r/min捣5-10min后，4000～8000r/min离心10-15min，上述操作重复2～4次，合并各次离心上清液，静置1.5～2h，其中，组织捣碎机内温度控制在20～30℃；在上清液中加入乙醇使其乙醇终浓度达到70％～75％，静置至沉淀析出，于4000～8000r/min离心10-15min，沉淀为HA粗提物；

(2)酶解：配制0.05～0.1mol/L的NaHCO₃水溶液和0.05～0.1mol/L的Na₂CO₃水溶液，以NaHCO₃水溶液：Na₂CO₃水溶液＝8～9∶1v/v进行混合至混合酶解液pH＝8.3～9.1，即得碱性缓冲水溶液；取上述碱性缓冲水溶液加入HA提取物，再加胰蛋白酶，酶比活力为1∶250，加酶量为原料质量的0.4～0.8％，于31～39℃，120r/min搅拌5～25h，得酶解液；

(3)除脂及非水溶性杂质：向酶解液中加入其体积10～50％的氯苯，并以800～1000r/min搅拌20～30min，再于4000～8000r/min离心10～15min，抽取上清液；向上清液中加氯化钠至0.1～0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀；

(4)除多肽

向1次初级HA沉淀中加入5.6g/L～11.2g/LNaCl水溶液∶0.5～0.6g/LNa₂HPO₄·12H₂O水溶液∶0.05～0.06g/LNaH₂PO₄·2H₂O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，其中，原料∶缓冲液＝1∶1g/ml；搅拌直至完全溶解，向溶液中加2～4倍95％乙醇，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除多肽的2次初级HA沉淀；

(5)除核酸及小分子多肽