[发明专利]基于核酸适配体检测水胺硫磷的电化学传感器及其制备方法

说明书

本发明涉及电化学传感器技术领域，特别涉及基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测水胺硫磷的电化学传感器。具体制备方法为：对电极进行预处理；将CP层修饰到电极表面；将均相反应混合液与HAP1，HAP2修饰到电极表面。本发明利用了核酸适配体的特异型识别，利用水胺硫磷的aptamer作为识别物质实现了对目标物水胺硫磷的高特异性检测；利用杂交链反应放大技术，实现了信号的放大，提高了传感器的灵敏度。

技术领域

本发明涉及电化学传感器技术领域，特别涉及基于目标诱导的核酸适配体构象变化检测有机磷农药的电化学生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

有机磷农药，是用于防治植物病、虫、害的有机化合物。这一类农药品种多、药效高，用途广，在农药中是极为重要的一类化合物。但有不少品种对人、畜的急性毒性很强，在使用时特别要注意安全。有机磷类农药对人的危害作用从剧毒到低毒不等。能抑制乙酰胆碱酯酶，使乙酰胆碱积聚，引起毒蕈碱样症状、烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。重度急性中毒者还会发生迟发性猝死。某些种类的有机磷中毒可在中毒后8～14天发生迟发性神经病，有机磷中毒者血胆碱酯酶活性降低。目前报道的检测有机磷农药的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振方法和荧光共振方法。这些方法都具有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测有机磷农药是至关重要的。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测有机磷农药的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测有机磷农药的电化学生物传感器。同时，本发明还提供了基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测有机磷农药的电化学生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：

Aptamer：5’-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3’（SEQ:ID:NO:1）；

Helper：5’-AGCTCTGTGCAGCCAAGCT-3’（SEQ:ID:NO:2）；

HAP1：5’-AGCTTGGCTGCACAGAGCTCAAGCT-3’（SEQ:ID:NO:3）；

HAP2：5’-AGCTTGAGCTCTGTGCAGCCAAGCT-3’（SEQ:ID:NO:4）；

CP：5’-SH-AGCTTGGCTG-3’（SEQ:ID:NO:5）。

Aptamer是抗水胺硫磷的适配体，Helper可以与aptamer杂交形成一个拱形探针。CP的5’端修饰巯基，可以通过Au-S共价键固定在金电极表面。

本发明的实现是基于目标物诱导的核酸适配体构象变化的无酶检测有机磷农药的电化学生物传感器。无酶检测提高检测的效率，传感器的稳定性。本发明中有机磷农药的检测是在均相溶液中实现的，通过Helper诱导双发夹的链杂交反应来提高检测的灵敏度，并获得较低的检测限。

均相中发生的反应是：当有目标物存在时，目标物与桥型探针中的aptamer发生特异性识别与结合，从而将Helper释放出来，呈游离状态。在电极表面首先修饰一层捕获探针(CP)，然后将均相溶液的反应产物与HAP1，HAP2混合液滴加到电极表面，在游离Helper的诱导下，修饰物中的双发夹发生杂交链反应，形成很长的杂交双链，并固定在电极表面。然后将修饰好的电极在亚甲基蓝（MB）溶液中孵育10min，使MB固定在杂交双链上。然后用电化学工作站检测其氧化还原峰。

在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是2h。