[发明专利]一种纤维二糖水解酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及酶基因工程改造技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，编码基因的一种核酸序列为SEQ ID NO：4。本发明提供的纤维二糖水解酶突变体比野生型的耐酸性更强，其最适pH为5.0，且在pH3.5‑7.0范围内均能保持65％以上的酶活水平，而野生型的最适pH为5.5。所述纤维二糖水解酶突变体可广泛应用于木质纤维素的降解，能显著提高木质纤维素的糖化率。其中，添加本发明所述纤维二糖水解酶突变体MAF6A的实验组2中木质纤维素的糖化率比对照组提高了6.5％，比添加野生型纤维二糖水解酶AF6A的实验组1提高了3.5％，取得了意料不到的技术效果。

技术领域

本发明属于酶基因工程改造技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体及其应用。

背景技术

纤维素酶(Cellulases)是水解纤维素(β-1，4葡聚糖或者β-D-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖(cellooligosaccharides)和类似物质的酶。纤维素酶在传统上已被分为三个主要类型：内切葡聚糖酶(endoglucanases，EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucoside glucohydrolase，EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶体部分，而外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶是唯一可以作用于晶体纤维素的酶组分。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在对于晶体纤维素的有效溶解是必需的。

纤维二糖水解酶由3个部分组成：具有催化活性的催化结构域，作用为锚定纤维素的纤维素结合域以及连接这两个结构域的一段短肽。在水解纤维素过程中，纤维二糖水解酶主要作用于纤维素线性分子非还原端，水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，使结晶纤维素成为易溶解的非结晶纤维素。

当前经济过分依赖于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性导致资源逐渐枯竭，燃烧产生的二氧化碳已造成气候环境的日益恶化。寻找可再生的清洁能源成为各国科研人员关注的焦点。其中生物质能源因具有来源广泛、价格低廉、再生性强等优点，成为最具潜力的能源物质。生物乙醇是源于可再生物质的重要能源之一。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，全球每年通过光合作用产生的植物约10000亿吨，为避免与人争粮，木质纤维素将成为生物乙醇生产最具潜力的原料。

木质纤维素炼制生物乙醇过程通常包括预处理、水解、发酵、蒸馏等单元操作，其中纤维素水解为可发酵糖是纤维素乙醇炼制过程中至关重要的环节。目前，木质纤维素的降解主要有化学法和酶法水解。与化学法水解相比，酶法水解工艺条件温和，设备简单，能耗低，同时具有副产物少、环境友好等特点，受到广泛重视并取得重大进展。

由于木质纤维素中的纤维素主要以结晶状态存在，因此纤维二糖水解酶在木质纤维素水解中的作用相当重要。但目前现有的纤维二糖水解酶活力低，耗酶量大，发酵成本高，且其在酸性条件下的酶解效率和转化率普遍偏低，严重限制了木质纤维素在生物乙醇生产中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维二糖水解酶变体及其应用。本发明通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白。所述突变体在酸性条件下的酶活力得到显著提高，且耐热性更强，能大大提高木质纤维素的降解效率，进而促进其在生物乙醇生产中的应用。

本发明一方面提供了一种纤维二糖水解酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维二糖水解酶第158位氨基酸由Asp变为Asn，第298位氨基酸由Asp变为Ser，第444位氨基酸由Glu变为Val。

上述纤维二糖水解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了一种重组质粒，其携带有编码序列为SEQ ID NO：4的纤维二糖水解酶突变体的基因。