[发明专利]一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用。

背景技术

近年来从世界范围来看由于抗生素的过度使用，造成细菌性感染和疾病呈上升趋势负面效应越来越大，耐药性菌株的不断出现也越来越引起人们忧虑，因此寻找、发现和生产新的抗生素的替代品已列入人们的议事日程。跨入新世纪以来，抗菌肽(Antibacterlalpeptides)是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肤,存在于多种生物体中,是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。由于自身的优点已日益引起人们的关注，并已成为研究的热点，其中牛乳铁蛋白肽(LactoferricinB)，不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等生物学功能，因此被认为是一种新型的抗菌药物和极具开发潜力的婴幼儿食品﹑饲料添加剂。

最初，日本研究人员发现天然牛乳铁蛋白的降解后，其抗菌活性比牛乳铁蛋白强400多倍，分离提取后发现活性物质为牛乳铁蛋白肽。然而从天然来源中分离牛乳铁蛋白肽产量低、费时长、工艺复杂，成本昂贵。此后，商业上用的牛乳铁蛋白肽是从牛奶中分离提取牛乳铁蛋白，再经过生物酶降解产物，产生牛乳铁蛋白肽。由于所原来降解牛乳铁蛋白的生物酶价格昂贵，因此这种方法生产的牛乳铁蛋白肽成本仍然较高。而人工合成牛乳铁蛋白肽及其衍生物费用更高，无法大规模生产。目前我国从新西兰进口的牛乳铁蛋白每吨价格为35万美元。尽管如此，随着生物技术的发展，牛乳铁蛋白已在欧洲和日本被进行商业化生产，用于制造母乳化婴儿配方奶粉或其它功能性食品。因此利用基因工程技术将牛乳铁蛋白肽基因转入其它生物中表达，为解决牛乳铁蛋白肽来源不足提供了新的途径。

基因工程表达法将是大量生产抗菌肽的理想途径。基因工程生产抗菌肽的表达系统主要是毕赤酵母和大肠杆菌,常选用表达宿主偏爱的密码子人工合成基因并进行克隆表达。原核表达系统是最早采用的表达系统,也是目前应用的较为经典的表达系统。该系统主要是将目的基因连接到载体上,再对其进行克隆,之后转化至细菌,通过诱导表达、纯化获得目的蛋白。该表达系统的优点体现在短时间内能获得目的蛋白,而且成本较低。但是，抗菌肽的大量分泌会对宿主产生有害作用，因此，目前主要通过重组蛋白技术将目的基因同谷胱甘肽硫转移酶，硫氧还蛋白，绿色荧光蛋白，外壳蛋白，类弹性蛋白，酮类固醇异构酶，小分子泛素样修饰蛋白等融合表达，降低了抗菌肽对宿主细胞的毒性。本研究选择谷胱甘肽巯基转移酶(GlutathioneS-transferase，GST)作为融合标签，尝试利用大肠杆菌表达系统制备牛乳铁蛋白肽(LfcinB)抗菌肽。

发明内容

本发明目的在于，提供一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用，该方法选取氨基酸编码序列NO.1为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2，并在苷酸编码序列NO.2设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，PCR扩增获得抗菌肽基因片段，分别构建重组表达载体，转化大肠杆菌后诱导表达。超声裂解菌体，十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，融合蛋白GST-LfcinB成功表达。融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化后，经羟胺剪切缓冲液切割融合蛋白，释放抗菌肽。通过琼脂扩散法抑菌实验检测其对大肠杆菌和金色葡萄球菌都具有明显的抑菌活性。克服了牛乳铁蛋白肽分子量较小而且容易被蛋白酶水解，往往造成产量低，难以产业化。本发明所述方法，大大提高了抗菌肽的产量。

本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，按下列步骤进行：

a、抗菌肽LfcinB基因的合成：