[发明专利]一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法

权利要求书

1.一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件，其中亮氨酸脱氢酶的基因序列如SEQID01所示，甲酸脱氢酶的基因序列如SEQID02所示；

(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的E.coli工程菌；

(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用pH6.5～8.5的缓冲液重悬、洗涤、配制成终浓度为0.05～100g/L的细胞液；

(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于pH＝6.0～13的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L-叔亮氨酸，三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和辅助底物在上述缓冲体系中的终浓度分别为0.015～0.300mol/L、0.5～1.5mol/L、0.005～0.2mmol/L和0.5～1.5mol/L，上述辅酶为NAD⁺或NADH，上述反应的温度为20～45℃，反应的时间为20～120h，震荡速率为150～300rpm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：

1)构建能够单独表达所述亮氨酸脱氢酶的第一生物砖元件；

2)构建能够单独表达所述甲酸脱氢酶的第二生物砖元件；

3)用上述第一生物砖元件和第二生物砖元件构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)为：

a、以含亮氨酸脱氢酶基因的质粒pUC18-leudh为模板，用引物LeuDH-F1和LeuDH-R1进行PCR扩增，得到亮氨酸脱氢酶基因序列，其中LeuDH-F1和LeuDH-R1分别如SEQID3和SEQID4所示；

b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述亮氨酸脱氢酶基因序列及终止子B0015，用T4DNA连接酶连接后形成质粒psB1C3-leudh-termintor转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒psB1C3-leudh-termintor；

c、用XbaI和PstI双酶切psB1C3-leudh-termintor，用SpeI和PstI双酶切psB1C3-LacI-rbs_B0034，用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+LeuDH转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒B0034+LeuDH，即得所述第一生物砖元件。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)为：

a、以含亮氨酸脱氢酶基因的质粒pUC18-fdh为模板，用引物FDH-F1和FDH-R1进行PCR扩增，得到甲酸脱氢酶基因序列，其中FDH-F1和FDH-R1分别如SEQID5和SEQID6所示；

b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述甲酸脱氢酶基因序列及终止子B0015，用T4DNA连接酶连接后形成质粒psB1C3-fdh-termintor转化大肠杆菌E.coliDH5α进行扩大培养，然后提取质粒psB1C3-fdh-termintor；

c、用XbaI和PstI双酶切psB1C3-fdh-termintor，用SpeI和PstI双酶切psB1C3-LacI-rbs_B0034，用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+FDH转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒B0034+FDH，，即得所述第二生物砖元件。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)为：用XbaI和PstI双酶切所述第一生物砖元件，用SpeI和PstI双酶切所述第二生物砖元件，用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+LeuDH-B0034+FDH转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒B0034+LeuDH-B0034+FDH，即得所述串联生物砖元件。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含氯霉素的液体扩大培养基的配方为：胰蛋白胨6.0～15.0g/L，酵母浸膏1.0～10.0g/L，NaCl5.0～15.0g/L，pH7.0～8.0，去离子水为溶剂，接种前添加氯霉素至终浓度为50～150ug/mL。