[发明专利]错配修复基因hMLH1异常剪接体的定性及定量检测试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种hMLH1基因异常剪接体检测试剂盒，特别涉及其在东亚胃癌高发人群的mRNA表达分析与后果评估。

背景技术

胃癌(Gastriccancer，GC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程。人类错配修复基因hMLH1胚系突变是遗传性非息肉性结直肠癌的重要病因，而在胃癌高发的东亚人群，部分家族性胃癌的发病亦与hMLH1基因功能异常相关。pre-mRNA选择性剪接是真核生物基因转录后表达调控的关键环节之一，构成蛋白质多样性的一个主要来源，也是生物细胞功能平衡系统调控的重要组成部分。选择性剪接产物的自然平衡维持细胞的正常功能，剪接过程的异常可导致这种功能平衡的破坏，使得细胞某些关键基因的功能性蛋白表达模式改变，与肿瘤等多种人类疾病的发病风险增高相关联。但是目前尚缺乏系统检测hMLH1基因剪接体异常的方法。因此有必要开发一种方便快捷的hMLH1基因异常剪接体检测方法，以用于胃癌的病因学分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种hMLH1基因异常剪接体的定性及定量检测试剂盒及其应用。

本检测试剂盒主要包括以下成分：

(1)hMLH1基因cDNAPCR定性扩增与测序引物2对，各对引物序列见表1；

(2)hMLH1基因cDNASYBRGreen法实时定量PCR扩增引物及探针8对，各对引物序列见表2；

(3)RNA提取试剂、逆转录酶，PCR扩增试剂，如dNTP、ExTaqHotStart聚合酶及SYBRGreen试剂等。

表1hMLH1基因RT-PCR引物序列

表2hMLH1基因SYBRGreen法实时定量PCR引物序列

本试剂盒扩增出的RT-PCR产物可以采用以下方式进行mRNA表达定性检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带位置进行分析，并对于电泳条带纯化后测序分析。

本试剂盒RNA逆转录产物还可以在ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem仪器上开展实时定量PCR反应，进行mRNA表达定量检测。

试剂盒中，还可以有琼脂糖凝胶、RNA提取试剂、DNA纯化试剂及SYBRGreen试剂等。

本发明所说的试剂盒用于检测hMLH1基因异常剪接体。

本试剂盒的检测hMLH1基因异常剪接体的步骤包括：

(1)提取组织或细胞RNA。

(2)RNA逆转录。

(3)hMLH1基因cDNAPCR扩增。

分别扩增hMLH1基因外显子10-11及外显子16–18区域。引物如表1所示。反应体系为20μl：TaKaRaExTaqHS聚合酶0.15μl、10×EXTaqbuffer2.5μl、dNTPMixture(2.5mMeach)2.5μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、cDNA1μl、ddH₂O11.85μl。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min。

将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，通过条带差异区分野生型或外显子跳跃型。条带经切胶纯化测序鉴定。

(4)hMLH1基因cDNAqPCR扩增。

SYBRGreen法实时定量PCR分析hMLH1基因外显子10-11区域和外显子16-17区域不同转录产物。引物如表2所示。反应体系为10μl：SYBR5μl、ROXReferenceDye0.2μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、cDNA1μl、ddH₂O3.4μl。反应条件：95℃30sec；95℃15sec，60℃30sec，共40个循环。

本试剂盒具有高效的异常剪接体检测作用。实施实例中报道，对于胃癌患者，针对hMLH1基因外显子10-11区域，采用试剂盒的功能评估方法提出，除了正常剪接的mRNA产物，还存在hMLH1外显子10跳跃、11跳跃及10-11跳跃等异常剪接产物，对于胃癌形成可能具有病因学意义。本试剂盒在胃癌患者hMLH1异常剪接体检测及病因学意义分析上具有重要作用。

附图说明