[发明专利]噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽

说明书

本发明涉及一种抗凝血活性多肽及通过噬菌体展示技术筛选抗凝血活性多肽的方法，属于抗凝血药物研发与应用技术领域；本发明通过蛋白表达载体的构建、靶蛋白的表达和纯化、靶蛋白的验证、噬菌体展示淘选特异性结合靶蛋白的生物活性肽、多肽抗凝血作用体内体外检测和毒性实验等过程，最终筛选得到的具有抗凝血活性的多肽；这些多肽是以肝素结合表皮生长因子为靶分子，经三轮噬菌体展示技术的淘选，以肝素钠为有效成分洗脱特异性结合靶分子的噬菌体得到的，该多肽可用于制备抗凝血药物；本发明多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，且在体内对小鼠无显著的短期和长期毒性，显示其在抗凝血药物研发方面具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及利用噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽，属于抗凝血药物研发与应用技术领域。

背景技术

凝血是机体重要的生理防御过程，但病理性血栓严重危害着人类健康。血栓栓塞症已经成为临床上常见的致残及致死的重要原因之一，它主要发生在心脑血管疾病患者、手术后病人以及孕产妇当中。此外，现代临床检验中，许多检验项目的血液标本需要抗凝来检测，而在体外血液很容易凝固。这就使得研究高效、稳定、副作用小的抗凝血药物或制剂成为一个有巨大临床应用价值和前景的热点。

能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。目前应用在临床检验的抗凝剂主要有天然抗凝剂(如肝素)、Ca2+鳌合剂(柠檬酸钠、氟化钾、EDTA、草酸盐等)，应用于临床治疗的主要有肝素、水蛭素、丹参、阿司匹林以及华法林等。其中肝素是一种酸性不对称结构的糖胺聚糖，抗凝作用在体内外均较强，在临床上应用比较广泛，但用量过大时会引起出血、血小板减少、骨质疏松、耐药性和过敏等副反应。水蛭素及其衍生物比伐卢定是肝素安全有效的替代药，可用于肝素诱导的血小板减少症，且不易发生导管血栓。水蛭素衍生物基因工程双功能水蛭素(RGD-hirudin)已于2005年获国家食品药品监督管理局批准进入临床研究，临床适应症为血管吻合术后的抗凝、防栓治疗，并可用于治疗心绞痛、深静脉血栓等疾病。比伐卢定(Bivalirudin,Hirulog)地西卢定(desirudin)及来匹卢定(lepirudin)是水蛭素的衍生肽。其中比伐卢定的效果较好，能通过用序列(D)-F-P-R-P结合凝血酶抑制凝血。小分子类肽代替(D)-F-P-R-P合成价廉及给药方便的抗凝血药,目前已取得很大进展,它们均为功能单一的凝血酶催化中心抑制剂或因子Ⅹa等抑制剂。丹参和阿司匹林通过抑制血小板聚集达到抗凝血作用。华法林是目前应用最广泛的口服抗凝药之一，为双香豆素衍生物，它通过与维生素K竞争羧化酶，阻碍凝血因子激活和阻滞抗凝，从而达到抗凝作用。临床用于预防或治疗血管内血栓形成及手术或受伤后引起的血栓性静脉炎等。

除此以外，目前国内外临床使用的主要抗凝血药物还存在能透过胎盘致畸、损害肝肾等副作用。而多肽药物由于其拥有小分子量，对天然蛋白酶酶解的稳定性相对更好，更易被人体吸收，而且其毒性小、副作用低、无蓄积性、分子认知性良好、构效关系明显、药效学显著，已成为国际抗凝新药研究的热点，已进入临床应用及临床研究的多肽主要有阿加曲班(argatroban)、希美加群(ximelagatran)、达比加群(dabigatran)等，还有一系列类肽化合物被合成。

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内，这样使得大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。