[发明专利]新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白

说明书

本发明公开了一种提高重组人TNFR75‑Fc融合基因表达量的方法，所述方法包括提高了一种新的SEQ ID NO：3所述TNFR75‑Fc融合基因；同时提供了一种载体为pCI‑gs‑TNFR75‑Fc；融合基因构建过程中，TNFR75的3’端引物中引入了18个碱基与人IgG1Fc基因片段5’端的18个碱基互补；同时对细胞株的筛选方法及MSX浓度、SEQ ID NO：3序列中人可溶性TNFRcDNA和人IgG1重链恒定区Fc段基因片段的制备方法进行了改进，最终提高了融合蛋白表达量。

本申请是申请号为201010268409.3，申请日为2010.09.01，发明名称为新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白的分案申请。

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种新型TNFR-Fc融合基因及其表达产物。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是人类最常见的自身免疫性疾病之一，患病率约1％，与人类白细胞抗原DR4/DR1明显相关，具有一定的遗传倾向。RA的临床特征多为手、足、腕、膝、臀等的关节滑膜发炎，最终导致关节损伤。滑膜炎引起大量淋巴细胞浸润，主要包括巨噬细胞、T淋巴细胞和浆细胞，同时血管增生。关节损伤主要发生于滑膜与软骨和骨毗邻处。

RA是一种以累及关节为主的系统性自身免疫性疾病。近年来研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是RA发病机制中的关键因子(Feldmann M 2001；RavinderN Maini,2001；RavinderN Maini,199),其可刺激机体产生一系列因子，如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子等的产生，并诱导内皮细胞表达黏附分子，吸引白细胞到受累关节。TNF-α还刺激滑膜巨噬细胞、纤维母细胞、破骨细胞和软骨细胞产生基质金属蛋白酶，并抑制软骨蛋白聚糖的合成，并可导致滑膜炎症和关节软骨的损伤。阻断TNF-α即可在RA发病机制的上游阻断炎症反应，达到治疗RA的目的。

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor Alpha，TNFα)和淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)是通过与其共同受体TNFR75和TNFR55结合而发挥生物学作用的。人肿瘤坏死因子受体75(TNFR75)由461个氨基酸组成，其N-末端235个氨基酸残基，是TNFR75蛋白酶水解下来的细胞膜外区片段，也称为可溶性TNFR75(sTNFR75)。

大量实验证据表明可溶性TNFR75和TNFR55(即受体的膜外部分)可以通过与TNFα和LT的有效结合而阻断TNFα和LT在生物体内的生物学作用(Hunns-Martin Lorenz,2002；smith，C.A.等(1990)，science，248：1019-1023)，且TNFR75分布更广发，亲和能力更强。但TNFR半衰期较短。

人IgG类免疫球蛋白半衰期可高达21天，它们是人类血液中最丰富的蛋白质，分为IgA、IgG、IgM、IgE和IgD，其中IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型。IgG1Fc段由232个氨基酸残基组成，包括铰链区、CH2区和CH3区。已有报道说将IgG的Fc绞链区中的半胱氨酸残基与其他蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。

国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFRII型受体部分与IgG的Fc片段的融合蛋白，此蛋白在离体条件下对TNF有中和作用(美国专利5,605,590)。国内也有构建此类融合蛋白，马菁等在CN1417334A肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及融合蛋白基因与产物中构建了一种含有linker的融合蛋白；刘昌闾等在CN1502632A新型TNFR-Fc融合蛋白中构建了一种截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用双顺反子构建了一种人肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅱ-抗体FC段融合蛋白。