[发明专利]一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法

权利要求书

1.一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。

2.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液为每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合2～4g、维生素组合3～6g、亚硒酸钠0～10mg和复方中药多糖20～50g；

所述的氨基酸组合包括天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺；

所述的维生素组合包括维生素B1、维生素B3和维生素B7；

所述的复方中药多糖由海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参提取得到。

3.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于该稀释液的pH为7.0～7.2。

4.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中得到。

5.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的氨基酸组合中含有：天冬氨酸20～50%、脯氨酸20～40%和谷氨酰胺10～60%，优选为天冬氨酸30～40%、脯氨酸25～35%和谷氨酰胺30～40%。

6.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的维生素组合中含有：维生素B115～35%、维生素B320～50%和维生素B720～50%，优选为维生素B120～30%、维生素B330～40%和维生素B735～45%。

7.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的复方中药多糖按以下步骤制得：

a、按海藻20～40份、地肤子5～20份、桑叶10～30份、牵牛子5～20份和丹参10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。

8.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液通过以下步骤制得：

1）磷酸缓冲溶液的配制：按比例称取氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、含6个结晶水的氯化镁溶于双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用；

2）复方中药多糖的制备

a、按比例称取海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉；

3）接种鸡胚用病毒稀释液配制：按比例称取氨基酸组合、维生素组合、复方中药多糖和亚硒酸钠，溶解于步骤1）制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.6～7.0之间，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用。