[发明专利]同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP快速检测试剂盒

说明书

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP引物组、试剂盒。发明人基于GeXP系统研究设计了6对特异性引物和1对通用引物，据此建立了同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP试剂盒。应用本发明可同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型，灵敏度为10²拷贝/μL。本发明具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，同时某些亚型禽流感病毒也能感染人类。禽流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原关系差异，可将其分为16种HA亚型和9种NA亚型。根据其致病性可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亚型。特别是近年来频繁爆发的H5亚型禽流感疫情给许多国家和地区的养禽业带造成了巨大的经济损失。2003年以来，H5N1亚型禽流感病毒疫情已经从亚洲逐步蔓延至欧洲以及非洲在内的共计56个国家和地区。2014以来，中国的黑龙江、江苏和湖南等省先后发生家禽感染H5N6亚型禽流感病毒的疫情，韩国、日本、荷兰、英国、德国、美国和中国台湾等地区相继出现H5N8禽流感疫情，还有2015年在美国爆发的H5N2亚型禽流感疫情，上述疫情均造成大量家禽死亡和被扑杀。此外，H5N1亚型和H5N6亚型AIV可以直接感染人并引起死亡的事件提示H5亚型AIV不仅给养禽业造成巨大经济损失，还可以跨越宿主种属屏障直接感染人进而危及人类安全。

目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。虽然多重PCR有着能同时扩增出多个目的因片段进而实现多种病原体的快速诊断并降低检验成本的优点，但是普通多重PCR在扩增的过程中容易受到目的基因模板的特性、引物浓度和比例及PCR所用的试剂之间的相互作用等的影响，进而导致样品扩增效率不一致使得检测结果的准确性大大降低。GeXP多基因遗传表达分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(Multiplex reverse transcription-polymerase chainreaction,mRT-PCR)是由通用引物(上游加荧光标记)和特异性嵌合引物(基因特异性引物5'末端连接通用引物序列)相结合建立多重逆转录聚合酶链反应体系，采用通用引物引发的策略，可以克服普通多重PCR存在的扩增效率不一的问题。此外，该方法利用毛细管电泳进行产物的分离，大大提高了检测结果的灵敏度和可靠性。目前，GeXP技术已经运用到新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒，手足口病病原，常见呼吸道病病原及HPV病毒等感染人类病原的检测与分型，本实验室也已经成功建立了同时检测鸡九种呼吸道疾病病原体的GeXP方法。

由于不同NA亚型的H5AI的爆发都具有发病急、传播速度快、临床症状相似及死亡率高等共同特点，现有的的诊断技术又很难在较短时间内对其作出准确的判定，不利于其防控及应急措施的制订。目前，检测H5亚型AIV的核酸检测方法多是针对其HA基因，同时检测H5、N1、N2、N6和N8基因并进行分型的技术尚未见有报道。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对H5亚型禽流感病毒的四种不同NA亚型进行检测和分型，达到快速鉴别目前对养禽业危害最大的H5N1、H5N2、H5N6和H5N84种组合禽流感病毒的目的，对H5亚型禽流感的流行病学调查及其防控，保障养禽业的健康持续发展具有重要意义。