[发明专利]利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法

说明书

本发明公开了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法。先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的载体pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp2质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，蚕蛾自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，育成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。

技术领域

本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法。

背景技术

蜘蛛种类繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112个科，3905个属，44000多种。蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌的一种天然高分子蛋白纤维，具有优良的机械性能，如弹性好、强度大、韧性强、耐高温和低温、耐冲击、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等优良特性，其独特的综合性能是其他天然纤维和合成纤维所无法相比的。典型的蜘蛛丝有7种类型，分别由7种不同丝腺分泌的不同的蛋白质分子组成。其中由大囊状腺(Major ampullate gland)分泌的主牵引丝(dragline silk)，呈放射状分布，构成蜘蛛网基本框架。牵引丝的强度是钢的5倍，因而拥有“生物钢”之美誉。牵引丝的蛋白基因是高度保守的，主要由分子量350kDa左右的、成对的牵引丝蛋白1(MaSp1)和牵引丝蛋白2(MaSp2)2种蛋白组成。

黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)牵引丝蛋白2(MaSp2)基因具有一个单一外显子，全长11340bp，编码3779个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每一个重复单元主要由2种初级类型重复序列以Type1-Type1-Type4串联而成，而每一种初级类型重复序列都包含了典型的An、GPGXX和GGX蛋白基序。碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。MaSp2被认为是牵引丝具有很强韧性的主要分子基础。

由于蜘蛛丝自身的产量低，且由于其相互残杀而不能通过大规模的饲养获得批量的蜘蛛丝，所以限制了蜘蛛丝的广泛应用。随着生物技术的快速发展和对蜘蛛丝的编码序列及吐丝机理的深入了解，已有采用各种异源表达系统来表达蜘蛛丝蛋白的研究，异源表达系统包括大肠杆菌、酵母(Pichia pastoris)、昆虫细胞(sf9、BmN)、仓鼠的肾脏细胞、转基因土豆、转基因烟草、转基因山羊、转基因老鼠、以及转基因家蚕。

但是，至今为止使用的各种异源表达系统都没有表达过蜘蛛牵引丝蛋白2，现有技术缺少了一种方法能分泌出尽可能长的、单一蜘蛛牵引丝蛋白2分子的蜘蛛丝。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法，利用转基因家蚕技术将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌单一的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的家蚕，获得以家蚕丝为本底的黑寡妇蜘蛛牵引丝，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

(1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒(如图1所示)以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；