[发明专利]基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法。

背景技术

细胞因子是由免疫细胞分泌的一类低分子蛋白，通常在免疫反应中发挥着信号转导的作用。最近，研究发现一些细胞因子介导的信号通路与肿瘤细胞的生存、入侵和转移有关，因此这些细胞因子已被当做癌症诊断和治疗的生物标志物。然而，由于一种癌症可能有多个标志物或者一种标志物可能对应多种癌症，因此利用多种生物标志物对癌症进行检测更加准确可行。

常用的细胞因子检测方法是酶联免疫吸附测试(ELISA)，该方法需要首先将细胞因子固定在特异性抗体上，然后利用酶或荧光团标记的二抗对其进行检测。但是由于该方法中目标物与信号的比例是1:1，其灵敏度仍然受到限制。另外，对于多重检测来说，这种方法也具有易产生假阳性信号、光谱重叠、淬灭效率不均一和仪器要求复杂等缺点。为了解决这些问题，多分子标记的微球、纳米线、条码策略和杂交链反应等被用于提高细胞因子检测的灵敏度。其中，条码策略具有很高的扩增效率，已被广泛用于生物标志物的灵敏检测。

条码分析作为一种灵敏的分析策略，是一种将短的寡核苷酸序列作为替代目标物的生物分析方法。传统的条码分析通常包括磁纳米颗粒和金属纳米颗粒，它们都修饰了识别单元，因此都能够识别目标物并形成三明治结构。另外，金属纳米颗粒上还修饰了大量的寡核苷酸序列，即条码链。由于纳米颗粒的富集作用，少量目标物序列即可被转化为大量条码链，因此这种方法通常具有很高的灵敏度。基于条码扩增策略，Mirkin课题组构建了一个蛋白类癌症标志物的多重检测方法，检测限达170pM。但是由于此类癌症标志物在血清中的含量极低，其灵敏度仍然无法满足实际检测的需要。此外，该方法需要将条码链从纳米颗粒上释放，增加了检测的复杂性。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，步骤如下：(1)将目标物的抗体固定在硅烷化的玻璃基底上；(2)将目标物和磁纳米探针依次加入到上述的玻璃基底上形成三明治式的免疫复合物，所述磁纳米探针通过将二抗和寡核苷酸修饰到streptavidin-MNBs上制得，所述的寡核苷酸链作为一级条码链；(3)上述的一级条码链作为扩增原件触发多分枝的杂交链反应，产生带有多条分支的长双链结构；(4)所述的长双链结构作为二级条码链与多分子标记的荧光探针结合，产生荧光；(5)通过数点进行计数。

具体的：一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，步骤如下：

首先将待测样品(优选血清)加入相应抗体包被的基底上，37℃孵育1-3h(优选2h)，利用PBS-T和PBS分别清洗后，加入磁纳米探针，37℃孵育1-3h(优选2h)后，除去未反应的磁纳米探针；接着，加入发夹结构混合物，和HCR缓冲液，37℃孵育2-4h(优选3h)，利用PBS-T和PBS分别清洗后，加入荧光探针，37℃孵育3-5h(优选4h)，最后利用PBS-T和PBS分别清洗，加入PBS，在倒置显微镜下进行成像。

优选：抗体被基体的制备：向硅烷化的玻璃基底加入抗体37℃下过夜孵育；接着，加入质量浓度(w/v)5％(取5μg BSA粉末加入到100μL PBS缓冲液中即得。)的BSA(牛血清蛋白)溶液在37℃下封闭5-8h(优选6h)。

优选：磁纳米探针的制备：首先，在外加磁场的作用下，将streptavidin-MNBs加入到TTL缓冲液中清洗，清洗完成后加入PBS使其悬浮，取streptavidin-MNBs溶液并加入生物素化的条码链(1-bio-strand和2-bio-strand，序列见表1)，37℃下反应，将得到的悬浮液在外加磁场的作用下，用PBS清洗后最终产物即为磁纳米探针，加入PBS备用；

优选：多分子标记荧光探针的组装：首先将三条荧光标记的单链DNA(1-Ca,1-Cb,1-Cc或2-Ca,2-Cb,2-Cc序列见表1)和一条长的单链DNA(1-Cd或2-Cd序列见表1)分别用TE缓冲液稀释；然后分别将各单链DNA加入TM缓冲液中，混匀；接着将混合物放入95℃的金属浴中，退火或淬火，制得荧光探针。

上述的方法应用于非诊断目的体外检测样品。