[发明专利]一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法

说明书

本发明涉及一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法。该方法建立了菌体浓度与电容率之间的关系模型，通过一种在线检测电容率的装置，实时监测培养液的电容率值，并建立了菌体浓度与电容率之间的关系模型，可以实时观察菌体浓度变化趋势，根据菌体浓度变化趋势图确定培养终点。该方法克服了培养基、纤维素丝、不容颗粒、气泡等对菌体浓度测定结果的干扰，并在小试、中试及工业化生产规模均得到了良好的应用。

技术领域

本发明属于生物发酵领域，特别涉及一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法。

背景技术

细胞纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是一类细菌合成的惰性高分子化合物材料。与天然纤维素结构相似，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成。而细菌纤维素又具有独特的物理结构和性质，如具有优异的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性，是世界是公认的性能优异的新型生物学材料。目前BC已经在食品、医药、化工、造纸、美容和滤膜等方面取得成功的应用。目前能够产生BC的细菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和Sarcina等，其中产量最高、应用最广的为木醋杆菌(Acetobacter xylinus)。

在发酵工业中，菌体浓度是最重要的工艺参数，培养基的利用情况、菌体代谢活性、产物利率和培养周期等，均与菌体浓度密切相关，因此在发酵过程中对菌体浓度进行监控显得尤为重要。然而，木醋杆菌在培养过程中，会被自身生成的纤维素丝包裹起来，发酵液中易形成絮状菌团，所以其菌体浓度的评价一直以来是个难题。

目前常用的菌体浓度评价方法有两大类：

1)传统离线检测方法，如分光光度法和干湿重法，前者的检测原理是通过测定细菌在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对菌体进行定量分析，但由于木醋杆菌培养基有较深的颜色及产生的纤维素丝会干扰光的吸收，造成检测结果往往有很大的偏差；后者是对培养液离心收集菌体，而后称量菌体的湿重或者干重，但由于木醋杆菌培养产生的纤维素丝也会随着菌体离心下来，且占有比较大的比例，因此检测结果也不准确。另一种常用离线检测方法为平板菌落计数法，检测结果比较准确，但该方法操作费时费力，一般需要3～4天才能得到结果，有很大的时间滞后性。另外，以上这些方法均需要隔一段时间取一次样，取样过程要打开生物反应器极易带进杂菌而造成染菌。

2)在线检测方法，如在线光学浊度法，但木醋杆菌的培养基颜色、不溶颗粒和大量气泡会干扰光的传播，虽然没有了取样的麻烦，检测结果也能时时在线更新，但检测结果偏差太大，因而无法应用于木醋杆菌菌体浓度评价。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法。该方法建立了菌体浓度与电容率之间的关系模型，在发酵液中加入气体分布器有效减少了发酵液中的纤维素菌团之间相互缠绕成团，插入两根工作电极，在两根工作电极产生的交互电场影响下，溶液中的离子向电极迁移，有完整等离子细胞壁的活细胞被极化，形成很小的电容。细胞浓度越高，等离子细胞壁越多，电容越大。不同于常规的光学仪器，该系统只针对活菌体，对于死菌体或者是培养液中的任何不溶颗粒都不敏感，因此检测的结果准确可靠。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法，包括如下步骤：

(1)菌株活化：取冻干保存的木醋杆菌涂布到平板固体培养基上，28-32℃培养4-8天生成单菌落，挑选上述培养好的单菌落，用接种环均匀涂在斜面固体培养基上，于28-32℃的恒温培养箱中培养2-4天。

(2)摇瓶培养：用无菌小铲取一小块上述培养好的斜面薄膜，接入摇瓶液体培养基中，28-32℃培养4-6h。