[发明专利]一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法

说明书

本发明提供了一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法，它包括如下步骤：a、取脂肪组织，洗涤，消化，离心，得细胞沉淀；b、清洗步骤a的细胞沉淀，置于含10％FBS的细胞培养基中，培养48小时；c、将步骤b中含10％FBS的细胞培养基更换为EGM2培养基，培养至铺路石样细胞克隆团出现，培养期间每2‑3天换液；d、将EGM2培养基更换为混合培养基，每2天换液，直至细胞汇合度达到80‑90％，即可。本发明还提供了制备得到的内皮克隆形成细胞。应用本发明提供的分离方法，可以从脂肪组织中高效的获得内皮克隆形成细胞；而且本发明方法操作简单、分离培养时间短，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法。

背景技术

内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)又称为血管母细胞(angioblasts)，是一类能增殖并分化为血管内皮细胞(Endothelial Cells，EC)的前体细胞。EPC在机体内参与血管新生和血管形成过程，在修复心肌梗死、皮肤损伤和治疗缺血性疾病、血管组织工程及肿瘤治疗方面具有广阔的应用前景。

EPC在细胞分化不同阶段具有不同的亚型，一般将EPC分为早期EPC(包括CFU-EC、CAC)和晚期EPC(即内皮克隆形成细胞，缩写为ECFC)，文献提供了不同EPC亚型的鉴定方法【1.Jin Hur et al,Characterization of Two Types of Endothelial ProgenitorCells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis,ArteriosclerThromb Vasc Biol,2004,24:P288-293.和2.DN Prater et al,Working hypothesis toredefine endothelial progenitor cells,Leukemia,2007,21:P1141–1149.】，其中，早期EPC形态为梭型，不能长期传代；ECFC呈现铺路石样形态，可以长期传代，增殖能力更强，能在体内形成血管结构。

EPC主要是从骨髓，外周血，脐血和脐静脉血管中分离培养获得，但存在操作复杂、来源有限、成本高等问题；脂肪组织具有取材方便、对供体创伤小等特点，尤其是可以直接利用美容手术后的抽脂废物，成本低且获取量大，因此，脂肪组织是分离获取EPC的理想组织来源。

现有文献报道的从人脂肪组织中获取EPC得到的均为早期EPC，例如公告号为CN1932010B的专利公开了一种分离人脂肪组织中EPC的方法，该方法得到的EPC呈梭型，为早期EPC。目前还没有从人脂肪组织中分离获取ECFC的报道，从脂肪组织中分离得到增殖能力强的ECFC具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从脂肪组织中分离得到内皮克隆形成细胞的方法。

本发明提供了一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法，它包括如下步骤：

a、取脂肪组织，洗涤，消化,离心，得细胞沉淀；

b、清洗步骤a的细胞沉淀，置于含10％FBS的细胞培养基中，培养48小时；

c、将步骤b中含10％FBS的细胞培养基更换为EGM2培养基，培养至铺路石样细胞克隆团出现，培养期间每2-3天换液；

d、将EGM2培养基更换为混合培养基，每2天换液，直至细胞汇合度达到80-90％，即可；

其中，混合培养基由等体积的EGM2培养基与含10％FBS的细胞培养基组成。

细胞克隆团是指由一个细胞分裂增殖得到的细胞数量在50个以上的细胞群体。