[发明专利]一种基于三色荧光标记的核酸测序方法

说明书

本发明公开了一种基于三色荧光标记的核酸测序方法。该方法将四类测序探针或核苷酸中三类用不同荧光染料标记、而另一类未做标记。每个DNA模板每次的测序信息通过比较三类标记染料的荧光强度、以及DNA模板定位的杂交荧光强度而获得。当三类荧光强度的数值有明显不同，且其中一类荧光强度数值分别高于另外两类荧光强度数值的3倍以上时，这个高的荧光即为测序信息；而当三类的荧光强度数值相差不大、且其强度低于DNA模板定位的杂交荧光强度的1/3时，未标记的探针或核苷酸即为测序信息。

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种基于三色荧光标记探针或核苷酸实现核酸序列高通量连接测序方法。

背景技术

DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命性提高，一次能同时对几百万甚至几千万条DNA序列进行测序。目前主流的高通量测序技术主要有三个代表：Roche公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术以及ABI公司的SOLiD测序技术。在现有的测序技术中，通过采用标记探针的连接测序方法或者标记核苷酸的合成测序方法均采用四色标记的原料实施测序反应。具体而言，合成测序技术采用边合成边测序的方法，在合成反应中，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，采集4色荧光之后，将3’端阻遏基团切除，还原为羟基，随后进行第二次循环，重复第一个循环的步骤，直到模板序列全部被合成双链DNA；而连接技术采用DNA连接酶和带有4种荧光标记的寡核苷酸探针序列，采集4色荧光之后，将标记基团切除、并衍生出随后进行第二次循环需要的基团，重复第一个循环的步骤，直到模板序列全部被合成双链DNA。很明显，这种让每个核苷酸(或者探针)携带一个荧光标记，每一种标记的荧光颜色均不同于其它的核苷酸(或者探针)类型，其好处是可以通过比较四色荧光的扫描强度，直接读取四色荧光强度中最大者为测序信息。然而，这种四色荧光标记测序的方法存在下列不足：1)需要四色不同的染料用于标记，且这四种不同染料的发射波长尽可能不重迭，否则会相互之间发生干扰，这在现实的测序方法中的确存在；且每增加一种标记染料，标记费用也同时增加。2)每种染料需要单独的采集，每增加一种染料需要增加相应的光学器件，即增加测序仪器的制造成本；同时，每增加一种染料就需要花费采集该染料的扫描时间，因而，增加测序时间；而荧光强度的采集占用了测序总时间的二分之一，且四种不同染料所花费的时间也不相同。在连接法测序中，采集异硫氰酸荧光素(FITC)的时间大约为采集德克萨斯红(Texas Red)、花青素5(Cy5)、花青素3(Cy3)三种染料的时间总和。因此，如果采用三色荧光、而不是现有的四色荧光标记方法实施高通量DNA测序，不仅测序仪器的复杂程度可以降低；同时，测序费用和操作时间也会大大降低，其效率将提高20％以上。然而，一个很明显的问题是，如何获取没进行标记探针的测序信息？根据现有测序方法，在进行序列测定前，首先会采用杂交标记序列的方法将所有芯片上的DNA模板进行位置确定。因此，每个DNA模板将有一个杂交的初始荧光强度数值。而当采用三色荧光标记进行测序反应时，每个不同位置上的DNA模板均可以获得三个不同的荧光强度数值。这三个数值包括两种情况：一种情况是包含“正确”的测序荧光，那么在这种情况下，“正确”的测序荧光强度数值就要明显大于另外两个“错误”的数值；第二种情况是不包含“正确”的测序荧光，那么这三种“错误”的荧光强度数值，相对于该DNA模板杂交的初始荧光强度就会少很多。从上述分析可以看出，三色荧光标记的测序方法同样可以获取准确的测序信息。

发明内容

发明目的：针对现有四色荧光标记测序技术存在的问题，本发明提出了一种基于三色荧光标记的核酸测序方法。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种基于三色荧光标记的核酸测序方法，使用四类核苷酸或探针进行测序，其中，三类核苷酸或探针是用不同荧光染料标记、而另一类是未做标记的，每个DNA模板每次的测序信息通过比较三类标记染料的荧光强度、以及DNA模板定位的杂交荧光强度而获得。