[发明专利]利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法

权利要求书

1.一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

(1)通过转基因育成带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕和带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕；

所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因是包含2倍到16倍MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4；MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4基因序列如SEQ IDNO.1；

所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因是包含3倍到24倍MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4；MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4基因序列如SEQ ID NO.2；

(2)将上述两种转基因家蚕品种杂交，育成F1代杂交品种；

(3)将F1代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成F3代；

(4)F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾在同一蛾区饲养，并同时采用Western Blot技术检测，筛选出同时表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代；

(5)F4代开始均采用与F3代同样的方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成两个黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白基因都纯合的家蚕品种；

(6)通过家蚕丝腺细胞同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

2.根据权利要求1所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：

所述步骤(1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕采用以下方式培育获得：

A1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；

A2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因插入到家蚕基因组内；

A3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

A4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

A5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

A6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕。