[发明专利]一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方法和在传染性法氏囊病病毒浓缩与纯化中的应用。所述类弹性蛋白多肽(ELP)与热应激蛋白90α(Hsp90α)融合蛋白由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒(IBDV)结合片段M167a组成。其制备方法包括融合表达载体的构建、融合蛋白的表达与纯化、IBDV结合片段的确定以及IBDV的浓缩与洗脱。与其他方法相比，用本发明的融合蛋白浓缩和纯化传染性法氏囊病病毒具有简单、快速和经济等优点，制备的传染性法氏囊病病毒可用于实验研究和疫苗制备。

技术领域

本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白的制备方法及其在传染性法氏囊病病毒浓缩和纯化中的应用。

背景技术

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种高度接触传染性传染病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。病毒浓缩与纯化是病毒分子生物学研究和疫苗制备的重要环节。现有的IBDV浓缩方法主要有氯仿抽提和聚乙二醇沉淀等，纯化方法主要有差速离心、密度梯度离心和亲和层析等，这些方法均存在费时、费力、回收率低和费用高等缺点。另外，目前缺少快速、敏感、经济的IBDV环境监测方法。

病毒受体结合捕捉技术是近几年出现的病毒浓缩与纯化新技术，其基本原理是根据病毒与受体结合的特异性，利用病毒受体蛋白偶联的磁珠等固相载体从病毒感染组织、动物食品和环境样品中捕获病毒，与PCR等技术相结合，还可用于病毒的环境监测。该技术具有快速、高效等优点，但所用磁珠的价格昂贵、需要专门仪器设备，其实际应用受到限制。

热应激蛋白90α(Hsp90α)是IBDV的受体复合物成分，能与病毒颗粒及其VP2蛋白结合，因此可以作为捕捉IBDV的诱饵蛋白。Hsp90α分为N端结构域、中间结构域和C端结构域，但其IBDV结合区尚不清楚。

类弹性蛋白多肽(ELP)是根据弹性蛋白相关序列合成的五肽(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸)聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈溶解状态，高于相变温度溶液中呈凝聚状态。本课题组用ELP与腺病毒受体融合蛋白建立了简单、经济的重组腺病毒浓缩与纯化方法，但ELP与Hsp90α或其片段融合后能否保持可逆相变特性，并用于IBDV浓缩与纯化还有待研究。

本发明将重组大肠杆菌表达的ELP-Hsp90α融合蛋白用于IBDV的浓缩与纯化，尽管这种策略在理论上是可行的，但在具体设计时却面临以下技术问题：Hsp90α或其片段能否在大肠杆菌中高效和可溶性表达、表达的ELP融合能否与IBDV结合、IBDV结合区位于哪个片段、最佳的结合条件是什么、如何洗脱与融合蛋白结合的病毒且不被灭活、结合融合蛋白的IBDV能否感染易感细胞。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种类弹性蛋白多肽(ELP)与热应激蛋白90α(Hsp90α)融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白，由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒(IBDV)结合区组成。经病毒浓缩和纯化试验证明，利用该融合蛋白能从感染细胞培养上清、裂解细胞以及病毒污染模拟水样中浓缩和纯化IBDV。

为了确定IBDV结合区，本发明分别将ELP与全长Hsp90α或其片段进行融合表达；在不同条件下将融合蛋白与IBDV进行共孵育，以便确定融合蛋白结合IBDV的最佳条件；通过对洗脱条件的系统优化，使IBDV能从融合蛋白有效洗脱并不被灭活。最终，本发明选择含IBDV结合区的最短融合蛋白ELP-M167a进行IBDV浓缩与纯化，以便在大肠杆菌中高效表达和减少IBDV结合的非特异性。

本发明所采用的技术方案是：一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白，是ELP-M167a，由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒结合片段M167a组成，所述M167a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。