[发明专利]基于水解探针法的快速检测地中海贫血HPFH缺失型的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血HPFH缺失型的试剂盒。

背景技术

地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫。中国人群中，α-地贫的基因型常见的为缺失型--^SEA、-α^3.7和-α^4.2。在日常检测中，申请人发现β地贫中的HPFH-SEA缺失在人群中有一定的分布几率，而HPFH-SEA缺失等位基因并未在常规地贫检测试剂盒以内。为了避免HPFH-SEA缺失等位基因的漏筛，需要建立一种可以快速诊断HPFH-SEA等位基因的检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血HPFH缺失型的试剂盒。采用该试剂盒中可以实现单管单次反应完成HPFH-SEA缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。

本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血HPFH缺失型的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其中：

所述的扩增引物为：一对扩增β-珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R，其中：

HPFH-F：5’-TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3’；

HPFH-R：5’-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’；

所述的特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的荧光探针HPFH-Prob，具体为：

HPFH-Prob：5’-6-FAM-TGTTTGCCTGCTTTAAGTTCCAGACCT-BHQ-2-3’。

上述试剂盒中的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，BHQ-2是指荧光淬灭基团。

本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血HPFH缺失型的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl₂和dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液；当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaqDNAPolymerase时，缓冲液则优选为与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。

采用上述试剂盒快速检测地中海贫血HPFH缺失型等位基因的方法包括以下步骤：

1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；

2)配制反应体系，具体为：

将引物HPFH-F和HPFH-R，荧光探针HPFH-Prob，以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；

3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；

4)数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果，当FAM通道有Cq值读数时，则表示该样本携带HPFH-SEA等位基因；当FAM通道没有Cq值读数时，则表示该样本不携带HPFH-SEA等位基因。

上述方法的步骤1)中，采用现有常规方法制备DNA模板。

上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA：1～3ng/μL；各引物：0.3～0.5μmol/L；探针浓度为0.3～0.5μmol/L；DNA模板：20～200ng；镁离子：1.5～1.9mmol/L；反应体系的终体积优选为20μL。

上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95℃预变性8～12分钟，然后95℃15～30秒，60℃退火50～70秒，39～49个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、采用本发明所述试剂盒中可以实现单管单次反应完成HPFH-SEA缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。

2、无需开管操作，极大限度地降低了实验室PCR产物污染的可能。

3、采用荧光水解探针的实验方案比现有其他方法所需时间少，对设备要求不高。

附图说明

图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；

图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线。