[发明专利]重组成纤维细胞生长因子-8b的生产方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组成纤维细胞生长因子-8b的生产方法及其用途。

背景技术

成纤维细胞生长因子-8(fibroblastgrowthfactor8，FGF-8)属于成纤维细胞生长因子家族成员，与已发现家族成员具有30％～40％同源性。FGF8最早于雄激素依赖的小鼠乳腺癌细胞株SC-3提取获得。人FGF8基因位于染色体10q24区段，有6个外显子，由233个氨基酸组成，成熟FGF8是由去掉N端39个氨基酸信号肽的194个氨基酸残基组成的多肽(分子量约为23kDa)，是等电点约为10.5的碱性蛋白。人FGF8具有a、b、e、f四种亚型，FGF8b为其优势表达型，且其与FGF受体的结合能力最强。广泛的文献报道FGF8与胚胎发育，细胞增殖、分化，肿瘤生长，组织损伤修复以及血管生成密切相关。研究表明FGF8是一种广谱神经营养因子，能维持神经细胞存活和促进神经干细胞定向分化成多巴胺(Dopamine，DA)神经元。基于以上特性，FGF8有望能够直接用于治疗退行性神经性疾病，因此受到学者的广泛关注。FGF8在实验研究的需求将会大大增加。

杆状病毒表达系统自20世纪80年代开始至今，已经成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一，重组杆状病毒载体具有重组蛋白生产能力强、生产周期短，安全可靠和易扩大等优点，而且表达的蛋白与天然蛋白结构和生物活性均非常相似，广泛用于基因治疗，疫苗生产，生物制药。

发明内容

针对以上发现，本发明利用昆虫杆状病毒表达系统表达成熟的FGF8b蛋白，获得具有生物活性的重组蛋白，为FGF8b的进一步研究开发奠定基础。

本发明的目的之一是提供一种重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法，以解决能够大批量生产具有生物活性的FGF8b蛋白的问题，满足生产和可以对FGF8b蛋白的需求。

本发明的还有一个目的是重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白用于治疗帕金森疾病的用途，通过帕金森细胞模型，能够看出本发明制备的FGF8b蛋白具有对帕金森细胞模型具有保护作用。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法，包括以下步骤：

步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因子-8b蛋白，具体包括：

1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF8b，其中FGF8b基因为成纤维细胞生长因子-8b基因，其碱基序列如SEQIDNO:1所示，

2)用步骤1)得到的一定MOI的Bacmid-FGF8b重组杆状病毒侵染昆虫细胞，侵染后于温度25～29℃下震荡悬浮培养36h～120h后收获细胞液；以及，

步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到成纤维细胞生长因子-8b蛋白。

优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤2)中，使用MOI为8的Bacmid-FGF8b重组杆状病毒侵染昆虫细胞。

优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤2)中，用Bacmid-FGF8b重组杆状病毒侵染昆虫细胞后于温度26.5～27.5℃下震荡悬浮培养60h后收获细胞。

优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤1)中，获得的所述重组杆状病毒Bacmid-FGF8b为第四代重组杆状病毒。

优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤1)中，获得重组杆状病毒Bacmid-FGF8b的具体方法包括：

步骤1.1)以pUC57-FGF8b载体为模板，利用如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因片段，并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-FGF8b重组载体；

步骤1.2)利用步骤1.1)中得到的pFastBac-FGF8b重组载体转座含有Bacmid质粒的E.ColiDH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-FGF8b重组载体；

步骤1.3)利用Bacmid--FGF8b重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒；

步骤1.4)将步骤1.3)中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法侵染昆虫细胞直到得到第四代重组杆状病毒。