[发明专利]一种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体表达量的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是涉及一种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体表达量的方法。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein，MT),又称巯基金属结合蛋白。一类非酶蛋白质，除含有镉(Cd)、锌(Zn)的MT外，在自然界也存在含有铜(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、铋(Bi)等元素的MT。MT的蛋白分子内不含有芳香族氨基酸和组氨酸。让MT中50％的金属离子发生解离的pH值分别为：Zn-MT:3.5～4.5；Cd-MT:2.5～3.5；Cu-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨基酸，故在280nm处无吸收峰，然而具有与金属相关的吸收峰。去金属的MT在190nm处有一个吸收峰。所有脊椎动物、多数植物和微生物体内都含有MT。无论是自然产生还是诱导产生的MT，其氨基酸组成基本相同、主要不同在所含金属及其含量。目前产品主要从兔肝、马肾、猪肝和微生物(如粗脉孢菌)等中提取。

关于金属硫蛋白的功能和开发利用，自1978年到1999年先后在瑞士、日本、美国共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。1987年我国将MT列入[863]计划，“八五”、“九五”重大攻关项目，1994年列入国家级[火炬计划]；2003年MT项目被国家科技部列为“国家科技成果重点推广计划项目,1995年联合国将MT列入向世界各国推荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对MT的研究、开发、推广、应用的高度重视。

关于MT蛋白的生物发酵生产，曾经有用大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌、酵母菌等基因工程重组方法，但均由于表达量过低而至今未有投入生产。

MT4在主要存在于人类皮肤组织中。皮肤是人类最大的器官，外界灰尘中和污染物中(如含铅化妆品中)的重金属可以通过接触皮肤而被吸收，各种辐射(如太阳光的紫外等)可以导致皮肤和皮下产生自由基，从而加速皮肤的胶原纤维、弹性纤维老化(被自由基氧化)而失去弹性，被氧化的细胞衰老凋亡，被氧化的DNA容易突变致癌，因此，皮肤除了有全身分布的MT1和MT2外，还重点“布防”有MT4，故而MT4具有皮肤组织特异性，是皮肤重金属入侵防护和延缓皮肤衰老的重要因子，在护肤、延缓衰老、缓解皮肤过敏的抗衰美容日化产品中有重要用途。

发明内容

鉴于以上表达量不足的缺陷，本发明的主要目的是利用人工基因全合成的方法将密码子优化，并且将表达子首尾串联重复4次成为包含4拷贝MT4顺反子的原核(E.coli)表达载体，用以提高表达量。

一种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体表达量的方法，包括将含经密码子优化后的人金属硫蛋白分子MT4的编码区的串联单位在原核表达载体克隆区串联重复4次形成包含4拷贝人金属硫蛋白MT4顺反子的串联重复区；将含串联重复区的原核表达载体转化原核宿主细胞；培养并大量繁殖该细胞，利用诱导剂诱导导人金属硫蛋白分子MT4表达。

本发明方法还可进一步包括利用现有技术对诱导表达的人金属硫蛋白MT4进行分离纯化的步骤。

其中，每个所述的串联单位优选包括核糖体结合区和经密码子优化后的人金属硫蛋白分子MT4。

每个所述的串联单位还优选包括位于串联单位两端的酶切位点。

经密码子优化后的MT4编码区序列优选如SEQIDNO.1所示。

经密码子优化后的MT4编码区的串联重复区序列如SEQIDNO.2所示。

经密码子优化后的人金属硫蛋白分子的编码区基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种用于提高人金属硫蛋白MT4原核表达量的串联重复区，所述的串联重复区由串联单位重复串联4次组成；所述的串联单位包括核糖体结合区和经密码子优化后的人金属硫蛋白MT4的编码区。

所述的串联重复区序列优选自SEQIDNO.5～SEQIDNO.8中的任意一种。

一种表达人金属硫蛋白MT4的原核表达载体，所述的原核表达载体含有本发明所述的串联重复区。

本发明具有以下优点：

1、所述人MT4蛋白的优化密码子提高了大肠杆菌内该类密码的可获得性。

2、所述MT4原核表达载体中MT4表达顺反子增加了近3倍，MT4的平均表达量由单拷贝时的3.4％增加到平均8.9％，表达量增加了2.6倍；

3、所述MT4原核表达载体表达的MT4蛋白为天然单分子，并非融合蛋白。

附图说明

图1为本发明提供的一种MT4串联结构示意图。