[发明专利]抗绵羊包虫病感染的基因rEg.P29分子工程疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.P29分子工程疫苗及其制备方法。

背景技术

细粒棘球蚴虫病，俗称包虫病，目前尚没有商品化的疫苗。当前已有十余种候选分子，如Eg95、rEg14-3-3重组疫苗、铁蛋白重组疫苗、GST重组疫苗等，其中最早证实EG95是一种绵羊保护性细粒棘球蚴疫苗，其对绵羊的保护力为96-98％，其中国内康强等也在绵羊身上对EG95进行保护力验证，得到了90％的保护力。遗憾的是Eg95首先由国外研发成功的，即使开发成为真正的商品，其知识产权也不属于我们。而目前绝大部分包虫病候选疫苗分子都是通过小鼠继发感染实验完成，缺乏直接的应用价值，因为包虫感染主要通过其虫卵经消化道感染而不是继发感染；再者，小鼠亦不是细粒棘球蚴病(包虫病)主要的天然适宜宿主。

由于细粒棘球蚴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布，是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其中以新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省(区)流行最为严重，高发区约占全国面积的44％，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。

包虫病严重危害人类的健康和农牧业经济的发展。包虫病对人危害主要表现为在肝脏、肺、脑或肾等器官形成占位性包囊病变，以机械压迫与营养消耗等形式造成这些重要器官的严重损害，甚至导致个体死亡；而对于家畜而言，包虫病将会造成家畜的减产、品质下降等重大经济问题，并且作为寄生虫感染生活史的重要一个环节对人民生命财产安全带来巨大隐患。

目前，人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状，等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蚴或有手术禁忌的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。因此，无论是手术治疗，还是药物治疗，对于包虫病治疗都有很大的不足。对于家畜而言，目前很少有相应的诊疗措施。

要想从源头上防控包虫病，疫苗的研发将是必然选择。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预防研究引起了人们的广泛关注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蚴虫研究较为成功的重组疫苗有Eg95，它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫保护力达到96-98％。

羊作为细粒棘球绦虫最主要的天然中间宿主，是细粒棘球蚴绦虫感染生活史的重要环节，制备出羊的包虫病疫苗，预防家畜羊的感染，阻断寄生虫生活史进而减少传染给人的几率，具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前没有羊包虫病疫苗的现状，提供一种基因分子rEg.P29在制备抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗上的应用，同时提供这种疫苗及其制备方法。

本发明技术方案如下：

一种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.P29基因分子rEg.P29，再构建P29/pET28a原核表达载体，在大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达重组的蛋白rEg.P29疫苗，其保藏号为：CCTCCM2015425；

一种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗的制备方法，首先从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.P29基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号为AF078931，其次是构建原核表达载体，在大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达重组蛋白rEg.P29，经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后，His标签亲和层析纯化，-20℃保存；

基因分子rEg.P29用于制备抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗。

本发明的细粒棘球蚴重组疫苗在小鼠身上进行免疫保护验证，免疫保护力达到了96.6％。该疫苗候选分子将有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。

附图说明

图1为血清抗体检测图，显示采用ELISA法分别检测了血清中rEg.P29抗原特异性IgG、IgG1、IgG2与IgE抗体水平。

图2为血清因子检测图，显示经免疫接种后，疫苗组IFN-γ与IL-2显著升高，表明Th1型介导的细胞免疫应答显著激活；Th2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体液免疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。

具体实施方式

疫苗的制备：