[发明专利]抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗LGR5单克隆抗体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗LGR5单克隆抗体和应用。

背景技术

Lgr5(leucine-richrepeatcontainingGprotein)是近些年发现的重要的干细胞和肿瘤干细胞标记分子，它是一个类似于促甲状腺素受体抗体(Thyrotropinreceptor,TSHR)的G蛋白，他们的胞外区都有一个富含亮氨酸的重复区域，不同的是Lgr5有18个重复，TSHR有9个重复。Lgr5最早是作为小肠的干细胞分子标记发现的，它是WNT信号通道下游激活的基因之一，与此同时，Lgr5的配体R-spondin和Lgr5的结合也使得细胞对WNT的刺激更为灵敏。在小肠中，遗传标记的一个Lgr5阳性的细胞可以形成整个小肠绒毛结构；在体外培养的体系中，Lgr5的阳性细胞也可以形成多种小肠细胞和分泌腺体。此外，Lgr5阳性细胞在正常的胃组织中也被发现具有干细胞功能，并且也是皮肤干细胞的一种。最近的小鼠遗传标记实验证明，Lgr5的阳性细胞在突变后可以导致结肠癌，并且这些细胞在结肠癌肿拥有肿瘤干细胞的特征。

随着近年来人们对LGR5深入的认识及研究，发现它在不同的肿瘤疾病(如结肠癌，胃癌，肝细胞癌，卵巢癌，皮肤基底细胞癌等)中的表达水平均有不同程度的升高。因此，LGR5被认为具有潜在肿瘤标志物的价值，目前主要用于标记结肠癌和胃癌的肿瘤干细胞。

目前在科研上通常通过流式细胞术(FlowCytometry，FC)检测LGR5来标记和分离干细胞和肿瘤干细胞，而临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理实验检测肿瘤组织内肿瘤干细胞中LGR5的表达状况。而不论是FC还是IHC，其实验方法的核心为特异性结合LGR5的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对LGR5蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗LGR5单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与LGR5蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO：11086。

本发明所述抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据LGR5ORF核苷酸序列(LGR5ORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，1566bp；LGR5氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry(货号PS100001，Origene公司)，构建LGR5重组表达质粒；

(2)LGR5重组蛋白的表达与纯化：将LGR5重组表达质粒转化HEK293T，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的LGR5重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的LGR5重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗LGR5特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得LGR5单克隆抗体。分别通过流式细胞术、免疫组化检测实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗LGR5单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UMAB212，亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11086。

同时，本发明还提供一种抗LGR5蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO：11086的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗LGR5蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得LGR5单克隆抗体。

本发明所述保藏编号为CGMCCNO：11086的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗LGR5蛋白单克隆抗体为IgG2a型，效价较高。将所述单克隆抗体于正常小肠组织和结肠癌组织中可见到小肠组织中隐窝基底柱状上皮细胞呈特异性表达，以及结肠癌组织中的肿瘤干细胞表达。