[发明专利]抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用。

背景技术

程序性细胞死亡因子1(processeddeath-1，PD-1)是由PDCD1基因编码的一个抑制性共刺激分子，由288个氨基酸残基组成的50-55kDa的I型跨膜糖蛋白，由细胞外IgV结构域、跨膜结构区域以及细胞内尾部结构三部分构成。它可表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞等单核细胞及树突状细胞(DCs)表面，提示PD-1在免疫调节中扮演着更关键的角色。PD-1作为表达在活化T细胞上的负性共刺激分子与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，可抑制T细胞增殖，并促进活化T细胞的凋亡；而PD-1抗体则可以阻断PD-1/PD-L1的结合，使效应T细胞发挥其肿瘤杀伤作用。

近年来，大量的研究表明PD-1可以作为一种重要的分子标志物在各种肿瘤中的预后诊断中发挥着重要的作用。在与PD-1相关的滤泡性淋巴瘤研究中，Wahlin等利用组织芯片IHC的方法检测滤泡PD-1阳性细胞比例可以作为独立表征预后良好的判定依据,但Takahashi等的研究认为PD-1并不能作为滤泡性淋巴瘤预后判读的有效指标，Richendollar等指出PD-1阳性T细胞比例越高，其病人的生存期越短，同样的研究也在霍奇金淋巴瘤中有报道。在肝细胞癌中，Shi和Zeng等研究发现瘤内PD-1+T细胞高比例与肝癌病人的无病生存期(DFS)呈反比，而外周微环境中的PD-1的表达水平可以作为独立判定无治疗生存期(TFS)的预后指标。Thompson等研究发现肾细胞肿瘤病人中免疫细胞高表达PD-1蛋白与病人预后呈负相关。另有报道发现乳腺癌中浸润性淋巴组织中PD-1阳性细胞数与组织学分级相关。在利用贝伐单抗(bevacizumab)、弗氧嘧啶(fluorouracil)和伊立替康(irinotecan(FOLFIRI-B))治疗结直肠癌患者后，其外周血淋巴细胞中PD-1的过表达与预后较差相关。

目前在科研上通常通过流式细胞术(FlowCytometry，FC)检测PD-1来标记和分离干细胞和肿瘤干细胞，而临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理实验检测肿瘤组织内肿瘤干细胞中PD-1的表达状况。而不论是FC还是IHC，其实验方法的核心为特异性结合PD-1的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对PD-1蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与PD-1蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO：11085。

本发明所述抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据PD-1ORF核苷酸序列(PD-1ORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，864bp；PD-1氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry(货号PS100001，Origene公司)，构建PD-1重组表达质粒RC210364；

(2)PD-1重组蛋白的表达与纯化：将PD-1重组表达质粒转化HEK293T，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的PD-1重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的PD-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗PD-1特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PD-1单克隆抗体。通过免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UMAB199，亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11085。