[发明专利]仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法在审
申请号: | 201510704039.6 | 申请日: | 2015-10-27 |
公开(公告)号: | CN105349546A | 公开(公告)日: | 2016-02-24 |
发明(设计)人: | 王秀利;薛壮;李慧;周玮;仇雪梅 | 申请(专利权)人: | 大连海洋大学 |
主分类号: | C12N15/12 | 分类号: | C12N15/12;C12N15/10;C07K19/00 |
代理公司: | 大连非凡专利事务所 21220 | 代理人: | 闪红霞 |
地址: | 116000 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 刺参 凝集素 基因 重组 融合 蛋白 制备 方法 | ||
技术领域
本发明属于海洋生物基因工程领域,尤其涉及一种仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法。
背景技术
海参属棘皮动物们海参纲,约有1200多种,分布在我国海域的有140多种,其中品质最佳、药用价值最高的是产于中国辽宁、山东、河北等地的北太平洋沿海仿刺参(Apostichopusjaponicus)。近些年来,海参已经成为东亚和东南亚地区重要的生态经济物种,在中国北部沿海地区海参养殖业也迅速发展起来。然而,由于海洋中含有高浓度病原菌导致海参养殖严重的病害问题,制约了海参养殖业的健康发展。通过提高海参天然免疫力来抵抗外来病原体的侵害是海参健康养殖最科学有效的途径。
海参的免疫系统中存在多种免疫因子,包括凝集素、抗菌肽、溶菌酶、模式识别受体和补体C3等,目前对于凝集素(Lectin)的研究最为广泛、透彻。凝集素是一类非免疫起源、非酶的、可促使细胞凝集的蛋白质或多价糖结合蛋白,其分子中含有一个或多个可与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化的结构域,具有对糖、糖脂、糖蛋白高度亲和并专一结合的特性。凝集素具有识别细胞表面特异性糖结构的功能,并参与细胞凋亡、细胞粘附、促有丝分裂、跨膜信号转导和识别肿瘤细胞等生命活动。孙永欣等报道,海参体液中的凝集素具有修复伤口的作用;通过与外源细胞上的特异性糖结构相结合发挥凝集和调理杀伤作用。Cheung等研究表明,海洋物种中分离出来的凝集素具有高效的抗细菌、抗真菌、抗病毒、消炎、抗寄生物和抗癌变等多种活性,可见凝集素在海洋无脊椎动物的先天免疫中具有重要作用。然而,分离提取天然海参凝集素过程复杂、成本高,迄今为止还没有关于重组仿刺参凝集素基因、编码蛋白及制备方法的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法。
本发明的技术解决方案是:一种仿刺参凝集素基因,其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
一种如权利要求1上述仿刺参凝集素基因的重组融合蛋白,其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
一种上述仿刺参凝集素基因的制备方法,其特征在于依次按如下步骤进行:
a.提取仿刺参总RNA;
b.将仿刺参总RNA反转录合成3’-RACE-ReadycDNA和5’-RACE-ReadycDNA;
c.以3’-RACE-ReadycDNA为模板,用特异性引物Ajmbcl-3和UPM进行PCR反应,得到3’-FirstroundPCR产物,所述特异性引物Ajmbcl-3序列如下:
Ajmbcl-3:5'GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA3';
d.以3’-FirstroundPCR产物为模板,用特异性引物Ajmbcl-n3和NUP进行PCR反应,得到3’-NET-PCR产物,所述特异性引物Ajmbcl-n3序列如下:
Ajmbcl-n3:5'ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG3';
e.以5’-RACE-ReadycDNA为模板,用特异性引物Ajmbcl-5和UPM进行PCR反应,得到5’-FirstroundPCR产物,所述特异性引物Ajmbcl-5序列如下:
Ajmbcl-5:5'GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG3';
f.以5’-FirstroundPCR产物为模板,用特异性引物Ajmbcl-n5和NUP进行PCR反应,得到5’-NET-PCR产物,所述特异性引物Ajmbcl-n5序列如下:
Ajmbcl-n5:5'ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT3';
g.将3’-NET-PCR产物和5’-NET-PCR产物拼接得到完整凝集素基因片断。
本发明以所得到的完整凝集素基因片断为模板,用RT-PCR引物扩增出完整的凝集素基因片段,并将其连接到PMD19-T载体上,所得阳性克隆表达、纯化,即得到仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL。制备方法简单、纯化率高,所获得的仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL成本低、凝集活性高、表达量多、实验重复差异小、结果稳定、可控性强,可用于海参免疫增强剂的工业化开发,可以有效抑制海参病害问题,减少污染,建立健康的养殖环境。
附图说明
图1本发明实施例仿刺参凝集素目的基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。
图2本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。
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