[发明专利]一种检测兔豆状囊尾蚴囊液抗体的阻断ELISA方法

说明书

技术领域：

本发明涉及动物免疫检测，特别是一种检测兔豆状囊尾蚴囊液抗体的阻断ELISA方法。

背景技术：

兔豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫的幼虫豆状囊尾蚴（Cysticercuspisiformis）寄生于兔的肝脏、大网膜、肠系膜和腹腔内引起的一种绦虫蚴病。该病呈世界性分布，我国各地均有发生，且病情严重。据报道，从东北部的黑龙江、辽宁，到西北部的青海和新疆，从西南的四川、重庆和贵州，到东南部的福建和华南的广西，再到华中的河南，华东的浙江和山东等省，均有本病的发生，发病病率从5%到100%不等，平均感染率达到40%左右，死亡率在4%—20%之间。本病感染率高,对不同年龄和品种的兔均易感染。兔场一旦暴发此病，感染率几乎为100%。轻度感染的病兔表现消化紊乱，幼兔生长迟缓，成年兔消瘦，饲料报酬降低，容易继发其他疾病，大量寄生时可引起兔只死亡，严重威胁着养兔业的发展。近几年来在国内的流行范围不断扩大，病情越来越重，具有恶化的趋势，严重影响养兔业的发展。

目前，我国对本病的血清学诊断问题还没有解决，有效的血清学诊断方法还没有建立。据报道。张守发等（1994）首次在国内应用兔豆状囊尾蚴的囊液分馏物和猪细颈囊尾蚴的囊液作抗原，与兔豆状囊尾蚴的囊液和头节、囊壁抗原，用炭凝集试验检测了兔豆状囊尾蚴病的阳性血清及阴性血清，分析、比较了各种抗原诊断兔豆状囊尾蚴病的应用效果。结果表明，兔豆状囊尾蚴囊液通过葡聚糖凝胶G一200过柱，所得第二峰蛋自抗原性最强，特异性最好，阳性符合率最高；其次是兔豆状囊尾蚴的囊液抗原；而兔豆状囊尾蚴的头节、囊壁抗原性小，不能用于该病的诊断。此后，王晓霞等（2009）用豆状囊尾蚴的粗制蛋白建立了用于实验室诊断的Elisa方法，但检出率较低，不能用于临床检测。迄今为止，用于临床的检测兔豆状囊尾蚴病的血清学方法还未建立。

发明内容：

本发明的目的是提供一种检测效率高、检测结果准确的检测兔豆状囊尾蚴囊液抗体的阻断ELISA方法。

本发明的技术方案是，（权利要求部分）。

本发明的有益效果是：能提供一种对患豆状囊尾蚴的病兔进行临床诊断的方法，即可为临床治疗服务，又可为普查防疫服务，使豆状囊尾蚴病等到及时诊断和防治，从而提高养殖业的经济效益。本发明对城稳定养兔群体（中小型兔场）具有重要作用。在对养兔场的调查中发现，许多中小养兔场都是农民办的，由于豆状囊尾蚴病的流行，造成大量幼兔死亡，使很多兔场倒闭，社会闲散人员增多。如果能及时发现和控制本病，增加养兔收入，就会使养兔人员的积极性增高，吸收农村的闲散人员进入养兔业。这既可增加家民的收入，又能促进社会的安定团结。另外，本发明有助于阻断豆状囊尾蚴的恶性生物循环，具有净化环境，保障兔、犬和人类健康的作用。

本发明具有如下优点：（1）本发明通过对豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离、纯化和抗原性检测，建立了一种快速、敏感、特异的阻断ELISA方法来检测患豆状尾蚴病病兔血清中的特异性囊液抗体。（2）本方法有望对兔豆状囊尾蚴病进行生前的快速诊断，将在兔豆状蚴尾蚴病的临床诊断和防治中发挥重要作用，具有很好的经济价值和社会价值。（3）本发明确定了最佳抗原的包被量、抗体的稀释度、抗原的包被时间、最佳封闭液和封闭时间、最佳样品孵育时间和最佳显色时间等条件，检测的性能稳定，重复性好。（4）本发明只需要少量的血清样品，即可应用建立的检测兔豆状囊尾蚴囊液抗体的阻断ELISA方法对兔豆状囊病进行便捷、快速的检测。（5）本发明操作简单、检测速度快、既可对病例进行检测，又能大批量检疫。

附图说明：

图1是本发明所述的豆状囊尾蚴囊液的不同包被时间的反应结果曲线图，

图2是本发明所述的豆状囊尾蚴囊液的不同封闭时间的反应曲线图，

图3是本发明所述的高免血清的二抗不同稀释比例的反应曲线图，

图4是本发明所述的高免血清的不同二抗作用时间的反应结果曲线图，

图5是阻断ELISA的特异性分析曲线图。

具体实施方式：

步骤1

用微孔超滤离心管对豆状囊尾蚴囊液蛋白进行分离纯化的方法：

（1）取100kDa的微孔超滤离心管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后，倒满超纯水，置于4℃冰箱内，预冷5-10min；

（2）取1200μL全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400μL样品；

（3）提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个100kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，各自加入1200μL样品，离心处理30-35min；