[发明专利]耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，属于转基因农作物的检测方法，具体是耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

目前世界上大豆种植已遍及五十多个国家和地区，主产地主要是美国、巴西、阿根廷和中国，中国是栽培大豆的起源地。随着中国经济的发展，城市化进程加快，居民对大豆以及其副产品的消费日益增加，而且大豆广泛用于食品、医药和化学工业，但是国产大豆产量增长达不到市场需求，进口大豆的数量逐渐增加。

杜邦先锋国际良种公司研制转基因抗两种除草剂的大豆DP-356043，对草甘膦与磺酰脲类（SU）除草剂表现为双重抗性。转入GAT基因，编码对除草剂草甘膦的抗性，乙酰乳酸合成酶（ALS）基因GM-HRA，编码对磺酰脲类（SU）除草剂的抗性。DP-356043通过基因枪转化得到，插入序列为单拷贝。

我国已经批准抗除草剂大豆DP-356043作为可进口用作加工原料，为了对抗除草剂大豆DP-356043的流通进行规范管理，建立有效的抗除草剂大豆DP-356043的检测方法与体系，对转基因作物及其产品标识制度的实施和安全性评价具有十分重要的意义。

目前，转基因作物的检测方法主要有以下2类：

1）基于蛋白质的检测，现在应用最广的是酶联免疫吸附法（ELISA）以及Westernblot的检测方法，这类方法要求高质量、高特异性的抗体，否则会影响检测的准确性，检测的灵敏度较低；

2）基于DNA的检测，主要是针对转基因作物中的外源插入基因进行检测，主要有分子杂交技术、PCR检测技术和芯片检测技术，其中PCR检测方法是最主要、最准确的检测转基因作物的方法，但这类方法的反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；需要特定的PCR仪，扩增时间2～3小时，扩增结果需要进行终产物检测如电泳；电泳常用染料如EB等有较强毒性，且难以实行现场检测。定量PCR检测灵敏度高，所使用的荧光种类主要Taqman探针、SYBRGreenΙ和分子信标，随着反应进行，体系中产生的荧光信号值随之增大。其他两种方法较SYBRGreenⅠ染料法灵敏度相对较高，但是荧光定量PCR仪器成本较大。

综上所述，在生产实践中均需要一种快速、灵敏度高、操作简便、特异性强、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。

环介导等温基因扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，以下简称LAMP法）是Notomi和Okayama2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将恒温扩增目视检测技术、恒温实时荧光技术应用于快速检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

（1）引物液：含有上述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；

（2）反应液：含有12mMdNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，所述dNTPs、反应缓冲液和MgSO₄水溶液的体积比是7～9：4～6：2；

（3）DNA聚合酶：DNA聚合酶的浓度为7～9U/μl；