[发明专利]一类溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类内酰胺环调控的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和在生物检 测系统和疾病诊断中的应用。

背景技术

溶酶体作为一种细胞器几乎存在于所有的真核细胞中，其包含了超过60多种酸性 水解酶、组织蛋白酶以及多种具有特异性功能的膜蛋白酶。这些存在于溶酶体内部的酶，不 仅能够控制生物体内大分子的降解，而且对于许多特殊的内分泌功能也具有十分重要的意 义，在细胞的增长、凋亡、内吞、外排以及离子调控等过程中作用特殊。在溶酶体内部空腔 中，相对于正常细胞溶酶体的弱酸性环境（pH在5-6之间），肿瘤细胞内溶酶体pH则更偏向于 酸性（pH在4.5-5.5之间）。基于此，探究溶酶体内部pH分布及其波动，尤其是肿瘤细胞内溶 酶体的pH变化，可为表达肿瘤组织可视化检测提供有效途径，对研究癌症的发病机制、诊断 及其预防具有特殊意义。

荧光探针具有操作简单、灵敏度高、对细胞损伤小等特点，引起了疾病诊疗研发者 的普遍关注。目前市售的溶酶体靶向荧光探针存在成本高、背景信号大、灵敏度低、选择性 差等限制，有待进一步开发新品。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类内酰胺环隐色体调控的溶酶体靶向荧光探针。

本发明的另一目的是提供上述荧光探针的制备方法。

本发明还有一目的是提供上述荧光探针对弱酸性环境的高灵敏性响应及在活体 细胞中实现对溶酶体的靶向识别，并检测表达其pH波动信号，提供疾病诊疗信息。

本发明的实现过程如下：

结构式（I）所示的化合物，

。

结构式具体为：

。

上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将罗丹明B溶于1,2-二氯乙烷中，加三氯氧磷搅拌回流，反应后将反应液冷却，旋 干，得暗红色的中间产物罗丹明B酰氯；

（2）将步骤（1）所得罗丹明B酰氯溶于乙腈，加入三乙胺及2,6-二氨基吡啶或者化合 物2，搅拌回流，旋干，萃取，干燥有机相，旋干，经柱层析分离得到RS1或者RS2；

（3）将步骤（2）所得RS1与水杨醛溶于无水乙醇，冷却后旋干，经柱层析得到RS3，

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上述步骤（2）所述的化合物2经2,6-二氨基吡啶与乙酰丙酮在浓磷酸中制得，

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上述步骤（2）中，所述的罗丹明B酰氯与2,6-二氨基吡啶或者化合物2的摩尔比 1:1.2。

上述制备方法中，RS1及RS3柱层析分离的洗脱剂均为体积比30:1的二氯甲烷与 甲醇；探针RS2柱层析分离的洗脱剂为体积比9:1的乙酸乙酯与甲醇。

上述目标荧光探针在环境及生物体系中对pH检测方面应用，尤其是在生物体系亚 细胞层上，实现了对溶酶体的特异性识别，提供疾病诊治检测信息。

本发明所涉及的溶酶体靶向荧光探针采用螺内酰胺环隐色体的开、关环机理，由 内酰胺环开环形成罗丹明B强荧光的共轭醌式结构，从而产生易于检测的光学信号输出。本 发明所涉及的探针在环境体系中表现出很高的灵敏性，固定探针的浓度10μmol/L，加入 相应pH的缓冲溶液后，在不到2min的时间内，荧光强度即达到饱和，并且荧光信号稳定、可 靠。同时上述探针还表现出良好的可逆性和很高的抗干扰能力，本发明所涉及的探针在相 应pH区间内，其荧光信号与pH变化之间存在良好的线性关系，可以用于pH定量测量。由于上 述探针具有与癌细胞溶酶体pH吻合的pKa值，发明人将探针应用于生物体系，与商品化的溶 酶体靶向探针LysoTrackerGreenDND-26对细胞进行共定位实验，得到很好的叠加效果 图，表明探针可以作为溶酶体靶向探针使用，进一步的生物实验表明，其作为溶酶体靶向探 针在细胞膜透性、灵敏度、细胞毒性等方面均有优异的表现，可作为溶酶体靶向探针应用于 活体细胞实验中。

附图说明

图1是RS1、RS2及RS3在不同pH条件下的紫外吸收光谱图，探针浓度10μmol/L， Britton-Robison缓冲溶液/EtOH（V/V=8:2）；