[发明专利]一种人类肠道益生菌的优化分离方法有效

申请号：	201510706483.1	申请日：	2015-10-23
公开（公告）号：	CN105176822B	公开（公告）日：	2019-01-11
发明（设计）人：	彭永正;易江丰;郭先凤	申请（专利权）人：	广州康泽医疗科技有限公司;南方医科大学珠江医院
主分类号：	C12N1/02	分类号：	C12N1/02
代理公司：	广州凯东知识产权代理有限公司 44259	代理人：	姚迎新
地址：	510000 广东省广州***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	一种人类肠道益生菌优化分离方法
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【说明书】：

本发明提出了一种人类肠道益生菌的优化分离方法，包括以下步骤：步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中，厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16sRNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌。本发明的人类肠道益生菌的优化分离方法实用、简单、直观和便捷。

技术领域

本发明涉及人类肠道微生物分离领域，特别是指一种人类肠道益生菌的优化分离方法。

背景技术

益生菌与人体健康密切相关。目前在微生物领域还未有成熟且便捷的分离纯化益生菌的方法。2004年欧洲分离出第一株C-IFH菌株并命名为Akkermansia muciniphila,此菌在欧洲成人定值率约100％，具有明显的减肥降糖作用。他们分离此菌使用的方法复杂，所设计的技术较繁琐且昂贵，故后续此菌其它亚型的纯菌至今未见报道。如何快速分离纯化此类相关细菌成为探索C-IFH菌与疾病的相关性的关键技术突破点。

发明内容

本发明提出一种人类肠道益生菌的优化分离方法，解决了益生菌分离速度慢的难题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；

步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16sRNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌。

优选的，所述粘蛋白液体培养基及所述粘蛋白固体培养基中的粘蛋白为纯化后的粘蛋白。

优选的，所述PCR实验所用的PCR反应液包括引物一和引物二；其中，引物一的序列为CAGCACGTGAAGGTGGGGAC，其中，引物二的序列为CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT。

优选的，粪便标本接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养的温度为37℃，时间为4天。

优选的，菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养的温度为37℃，时间为3天。

优选的，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养的温度为37℃，时间为2天.

优选的，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养的重复次数为3次，每次培养的温度为37℃，时间为5天。

优选的，所述纯化后的粘蛋白是通过以下方法对粘蛋白进行纯化：

步骤一，试剂准备：

无水乙醇(4℃预冷)；

A液：无水NaH₂PO₄0.2g；Na₂HPO₄·12H₂O 7g；NaCL 6g；调节pH为7.8，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；

B液：NaCL 5.85g；调节pH为7.0，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；

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