[发明专利]一种检测阴沟肠杆菌O20型的引物及方法

说明书

本发明公开一种检测阴沟肠杆菌O20型的引物及方法，引物为两组核苷酸序列之一，第一组核苷酸序列的正向引物5’—AGAATCTTACACTGGCTTA—3’；反向引物5’—CTTAATACACCTGGCACA—3’；第二组核苷酸序列的正向引物5’—TTTGGCTATGGCCGTATT—3’；反向引物5’—GTGCAGATGCCTGATGAA—3’。在进行检测时，提取待检测样品的DNA，利用第一组核苷酸序列或者第二核苷酸序列作为引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测。本发明避免采用传统鉴定方法缺点，检测阴沟肠杆菌O20型时间短、特异性强、灵敏度高。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测阴沟肠杆菌O20型的引物及方法。

背景技术

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)作为一种革兰氏阴性粗短杆菌，广泛存在于自然界中，在土壤、植物、昆虫及人和动物的粪便中均可检出，是人和动物肠道正常菌种之一，同时它也是一种重要的条件致病菌。近年来，由于第三、四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，该菌的耐药菌株日益增多，使得临床上对该菌引起的感染性疾病的治疗趋于复杂化。耐药菌株的出现的主要原因是未能在第一时间辨明病原菌，在不明病原菌的情况下，滥用药物。80年代以来，陆续有文献报道了对阴沟肠杆菌进行血清型分型、噬菌体分型、细菌素分型，以及生物型分型等手段。但以上分型方法只能联合使用，由于单独使用一种方法分型的重现性不理想和分型能力弱，不能很好地将阴沟肠杆菌进行准确分型。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，识别病原体，从而进行针对性治疗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种针对阴沟肠杆菌O20型的检测引物及方法。该方法可用于阴沟肠杆菌O20型的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性强。

本发明的技术目的是通过以下的技术方案实现的。

一种检测阴沟肠杆菌O20型的引物为下述两组核苷酸序列之一，每组核苷酸序列由正向引物和反向引物组成：

第一组核苷酸序列：正向引物(SEQ ID NO.1)5’—AGAATCTTACACTGGCTTA—3’；反向引物(SEQ ID NO.2)5’—CTTAATACACCTGGCACA—3’；

第二组核苷酸序列：正向引物(SEQ ID NO.3)5’—TTTGGCTATGGCCGTATT—3’；反向引物(SEQ ID NO.4)5’—GTGCAGATGCCTGATGAA—3’。

上述引物在检测阴沟肠杆菌O20型中的应用，即检测阴沟肠杆菌O20型的方法，首先提取待检测样品的DNA，并以样品DNA为模板，利用第一组核苷酸序列或者第二核苷酸序列作为引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品中是否含有阴沟肠杆菌O20型。

在上述的检测方法中，采用第一组核苷酸序列作为引物时，若电泳结果在459bp位置出现单一条带，则说明样品中含有阴沟肠杆菌O20型；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌O20型。

在上述的检测方法中，采用第二组核苷酸序列作为引物时，若电泳结果在246bp位置出现单一条带，则说明样品中含有阴沟肠杆菌O20型；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌O20型。

在上述检测方法中，进行PCR扩增的反应体系为30μL的反应体系，具体为：10×PCRBuffer(含Mg²⁺)2.5μL；2.5mmol/L的dNTP 1μL；Taq酶1.5-2.25U；10μmol/L的引物(即检测阴沟肠杆菌O20型的引物，第一组核苷酸序列代表的引物对或者第二组核苷酸序列代表的引物对)0.1-0.3μL；10-300ng/μL的样品DNA(即模板DNA)1μL；最后用灭菌超纯水补至30μL。