[发明专利]一种简易的稻曲菌分离和保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及稻曲菌分离和保存技术领域，具体为一种简易的稻曲菌分离和保存方法。

背景技术

水稻稻曲病（Ricefalsesmut）是由稻曲菌（Villosiclavavirens(Nakata)E.Tanaka&C.Tanaka）引起的一种重要的真菌病害，病菌侵染穗部后形成大于谷粒数倍的稻曲球，其表面覆盖大量粉状的黄色或墨绿色的厚垣孢子。稻曲球不但严重威胁水稻的产量和质量，且能产生对人和牲畜有剧毒作用的真菌毒素(Koisoetal.,1994;Lietal.,1995)。近些年，随着水稻的N肥料使用量增加、杂交稻的大面积的推广，稻曲病的发生严重度日益增加，在发病严重的年份，导致的产量损失可高达50%。

国内外研究者普遍认为稻曲菌的厚垣孢子和菌核是稻曲病发生的初侵染源，两者通过萌发产生薄壁分生孢子直接侵染水稻。在有关稻曲病人工接种技术研究中，采用分生孢子进行注射和喷雾法接种效果更好(伏荣桃等，2015)，因此，在这些研究中成功分离和保存稻曲菌菌株是试验成功的一个重点。稻曲菌寄生性强，腐生性弱的特点，使得分离材料稻曲球上寄生着许多其它的细菌和真菌，同时病菌在人工培养基上生长极其缓慢，因此在分离培养过程中极易被其它细菌和真菌污染(Fuetal.,2013;王永强等，2010)。

近些年来，研究者们已陆续对稻曲病原菌的分离方法进行了研究，大多采用厚垣孢子悬浮液法、稻曲球不同层组织块分离法、菌核培养法等分离方法(周永力，1999；刘明霞等，2009)。以上这些方法都比较耗时，分离的成功率往往较低，且不同的报道的分离方法又有许多不一致的方面。此外，稻曲菌的室内保存方法，目前还尚未见报道。

发明内容

本发明针对以上技术问题，提供种一种简易的稻曲菌分离和保存方法，利用本发明的方法可以快速的分离到目的菌株并保存，解决了稻曲菌在分离时耗时、效率低的问题，同时也解决了菌株在保存过程中致病性退化、耗占空间等问题。

本发明的技术方案为：

一种简易的稻曲菌分离和保存方法，该方法包括以下步骤：

1）稻曲菌菌株分离：

从发病的稻田中采集新鲜的黄色、绿色、黑色的稻曲球样本，室温干燥7-10d备用。从采集的样本中挑选厚垣孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌30-40min；在无菌条件下用镊子取单粒稻曲球，轻轻震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培养基上；用移液枪取150-200ul无菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，培养4-5天；用无菌解剖针挑取单个白色的或黄色的单菌落于PSA培养基上纯化培养。

2）稻曲菌菌株保存：

无菌滤纸准备：将圆形滤纸剪成5-6mm的方形小块，装入玻璃瓶中在121℃下高温湿热灭菌20min，然后放入干燥烘箱中烘干至含水量小于5%、备用。

将分离纯化的稻曲菌菌株转到XBZ培养基上培养5-7d；在无菌条件下用镊子把滤纸小块放在培养有稻曲菌的XBZ上，每个培养皿放入6-7个滤纸小块；将培养皿继续放入28℃培养箱中12h光暗交替培养4-5周，直到滤纸上长有稻曲菌黄色的厚垣孢子堆；无菌条件下取出粘有黄色厚垣孢子的滤纸块，放在超净工作台上风干至含水量小于5%；将风干的滤纸块放入无菌的4×7cm长方形保存纸袋中，透明胶布封口；将装有滤纸块的保存袋放在无菌的牛皮纸袋中，且放入20-30粒硅胶干燥剂颗粒，封口；再将牛皮纸袋放入-20℃冰箱中保存备用。

3）保存菌株的活性检测

菌株保存于-20℃冰箱后，每隔1个月在无菌条件下挑取粘有厚垣孢子滤纸片，将滤纸片上的厚垣孢子震落在XBZ培养基上；用移液枪取150ul无菌水滴在含有厚垣孢子的XBZ平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，暗培养4-5天，观察厚垣孢子单菌落的生长情况。

由于绿色和黑色的稻曲球样本用于本申请中，其分离成功率较低，所以优选采用黄色的稻曲球标样。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：